Thema 2. Replicatie, transcriptie en translatie
ZSO1: DNA replicatie en PCR (SBU5)
Leerdoelen
- Beschrijven hoe het DNA molecuul is opgebouwd
- Uitleggen hoe DNA replicatie verloopt en bijbehorende reacties benoemen en omschrijven
- Uitleggen hoe fouten gemaakt tijdens DNA replicatie hersteld worden
- PCR uitleggen en beargumenteren of en hoe een gegeven vraagstelling opgelost kan worden
met PCR
- Aan de hand van een gegeven nucleotide de sequentie van de primers opschrijven nodig
voor PCR van DNA
Samenvatting Alberts
Structuur & functie van DNA
DNA-molecuul: polair van 5' (fosfaat) naar 3' (hydroxyl)
- Suiker-fosfaat backbones draaien elke 10 baseparen rechtsom (dubbele helix)
- Antiparallel: polariteit van beide strengen is tegengesteld georiënteerd
Template streng: complementair aan gesynthetiseerde streng
Coderende streng: hetzelfde als gesynthetiseerde streng
DNA-replicatie
DNA-polymerase 3: polymeriseert nucleotiden bij replicatie
DNA aflezen van 3'5' en maakt van 5'3'
- Leidende streng: direct van 5'3' synthese
- Volgende/lagging streng: okazaki-fragmenten
Replication fork: actieve stuk waar replicatie plaatsvindt
DNA-primase: produceert primer voor DNA-polymerase; maakt korte RNA-primers voor leidende
streng met ribonucleoside trifosfaten
DNA-ligase: plakt okazaki-fragmenten aan elkaar
DNA-helicase: verbreekt H-bruggen door ATP-hydrolyse
Single-strand DNA-binding (SSB) proteins: zorgen voor
behoud van geopende DNA-ketens
Sliding ring: houdt bewegend DNA-polymerase bij het DNA
DNA-polymerase 1: vervangt RNA door DNA bij einde
Okazaki-fragment
Fouten herstellen
, - DNA-polymerase: betere affiniteit met correcte nucleotide dan met incorrecte nucleotide
- 3'5' proofreading exonuclease: verwijdert ongepaarde/mispaarde residuen aan 3' primer,
want transcriptie stopt als er een ongepaard 3'-OH uiteinde aan de primer zit
o RNA wordt gemaakt zonder primer; mutaties hebben geen lange-termijn effect
Initiatie en completatie van DNA-replicatie
Initiator-eiwitten: binden aan DNA op replication origin en verbreken
de H-bruggen
1. Tijdens menselijke celdeling zijn er 30000-50000
replicatieoorsprongen
2. Verschillende celtypen hebben verschillende soorten
oorsprongen
3. Net als in bacteriën worden replicatie-vorken gevormd in
paren die in tegengestelde richting bewegen in een replicatie-
bubbel
Telomerase repliceert chromosoom-uiteinden
Laatste RNA-primer van de volgende streng kan niet vervangen
worden door DNA, omdat er geen 3'-OH uiteinde is voor de repair
polymerase
- Telomerase is complementair aan de repeats van telomeren
(mensen: GGGTTA) en vult ze na celdeling weer aan bij de
parent strand, zodat replicatie tot het einde van de DNA-
streng kan plaatsvinden
- Hoeveelheid en activiteit van telomerase is afhankelijk van
het type cel beschermt tegen kanker
-
Er moet voorkomen worden dat telomerase hersteld wordt,
- Shelterin: beschermende chromosoomkap die de telomeren 'verbergt'
- T-loops, waardoor het uiteinde verborgen wordt en niet meer aan het uiteinde zit
Genen klonen in vitro met PCR
,Samenvatting video DNA-replicatie
Primer/template junction: startpunt van de DNA-replicatie
DNA-helicase: ringvormig hexomeer, omcirkelt een DNA-keten, waardoor de ketens uit elkaar
geduwd worden. Verschilt per helicase in welke richting ze bewegen.
- De strengen blijven uit elkaar door SSP's die binden aan de enkele ketens van de volgende
streng; bij de leidende streng gaat de replicatie zo snel dat dit niet nodig is.
Sliding DNA clamp: ringvormig molecuul die om dubbelstrengs DNA gaat. Ze binden aan de
achterkant van DNA-polymerase, waardoor DNA-polymerase aan de keten gehouden wordt. Ander
zouden ze na ongeveer 100 baseparen alweer loslaten van de DNA streng soort personal trainer
Sliding DNA clamp loader: door binding van ATP kan loader binden aan sliding DNA clamp en aan
DNA-keten.
, Vragen
a. Chromosomen zijn opgebouwd uit eiwitten (oa. histonen) en DNA. Het DNA bevat de genen
b. AATCGGATT Altijd van 5' naar 3'!
c. 24% T, 26% G, 26% C
d. T + G + C = 76%
e. Beide oude ketens komen in één van de twee dochtermoleculen. Beide nieuwe moleculen
bevatten dus 1 nieuwe en 1 oude keten. Dit is dus semi-conservatief, omdat er 1 keten
behouden blijft en 1 keten nieuw gevormd wordt per nieuw DNA-molecuul.
Conservatief zou zijn dat de oorspronkelijke dubbelstrengs keten blijft bestaan en een
nieuwe dubbelstrengs keten bestaande uit twee nieuwe ketens wordt gesynthetiseerd.
f. Bij prokaryoten is er één startpunt, bij eukaryoten zijn er heel veel startpunten (origins of
replications) op één DNA-molecuul
g. DNA-polymerase
h. Primase, DNA polymerase, nuclease om RNA af te breken, ligase
i. Dit RNA is een template voor de verlenging van de telomeren
Werkgroepopdrachten
Vraag 1
- Nee, de pijlen staan niet allemaal de goede kant uit getekend. Replicatie moet plaatsvinden
van 5' naar 3' en dit kan dus niet binnen een streng van richting veranderen
- 2 replicatievorken
- De replicatie van het DNA is begonnen bij replication origin. Dit is in het midden van de
opengebroken 'ovaal', tussen de 2 vorken
- Okazaki-fragmenten
- Ja, ligase is nuttig om de okazaki-fragmenten met elkaar te verbinden, zodat er één DNA-
streng gevormd wordt
Vraag 2
De eerste fosfaatgroep (fosfaatgroep aan de suikergroep), want deze blijft ook na het inbouwen van
de nucleotide nog aan de DNA-streng vastzitten. De tweede en derde fosfaatgroep worden
verwijdert. De energie die hierbij vrijkomt wordt gebruikt voor de binding van de eerste fosfaatgroep
aan de suikergroep van de volgende nucleotide.
Vraag 3
a. Radioactieve bouwsteen: 3H-labeled Thymidine (3H-T)
Niet-radioactieve bouwsteen: BrdU (bromodeoxyuridine)
b. Bij toevoeging van deze bouwstenen kan er nog steeds replicatie plaatsvinden, dit proces
wordt niet verstoord door de toegevoegde bouwstenen. Het gebruik van bouwstenen is
handig, omdat je monoklonale antilichamen kan gebruiken die binden aan deze bouwstenen.
Daardoor is het heel makkelijk om de bouwstenen op te sporen.
c. Alleen de cellen in de S-fase worden gelabeld. De S-fase is een vrij korte fase dus lang niet
alle cellen waren tijdens het kweken in de S-fase. De bouwstenen kunnen alleen in het DNA
komen tijdens DNA-replicatie, dus cellen in andere fases zullen niet gelabeld worden.
Vraag 4
Het gebeurt aan het uiteinde van een keten, dus het is exonuclease. De fosfaatgroep wordt aan de 5'-
kant toegevoegd, dus dan is het 3'-5' exonuclease.
Vraag 5
Aantal baseparen mens: 3 miljard = 3.000.000.000
- Lengte Okazaki-fragment: 100-200 bp
- Aantal Okazaki-fragmenten: 3 miljard /150 = 20.000.000 = 20 miljoen Okazaki-fragmenten
ZSO1: DNA replicatie en PCR (SBU5)
Leerdoelen
- Beschrijven hoe het DNA molecuul is opgebouwd
- Uitleggen hoe DNA replicatie verloopt en bijbehorende reacties benoemen en omschrijven
- Uitleggen hoe fouten gemaakt tijdens DNA replicatie hersteld worden
- PCR uitleggen en beargumenteren of en hoe een gegeven vraagstelling opgelost kan worden
met PCR
- Aan de hand van een gegeven nucleotide de sequentie van de primers opschrijven nodig
voor PCR van DNA
Samenvatting Alberts
Structuur & functie van DNA
DNA-molecuul: polair van 5' (fosfaat) naar 3' (hydroxyl)
- Suiker-fosfaat backbones draaien elke 10 baseparen rechtsom (dubbele helix)
- Antiparallel: polariteit van beide strengen is tegengesteld georiënteerd
Template streng: complementair aan gesynthetiseerde streng
Coderende streng: hetzelfde als gesynthetiseerde streng
DNA-replicatie
DNA-polymerase 3: polymeriseert nucleotiden bij replicatie
DNA aflezen van 3'5' en maakt van 5'3'
- Leidende streng: direct van 5'3' synthese
- Volgende/lagging streng: okazaki-fragmenten
Replication fork: actieve stuk waar replicatie plaatsvindt
DNA-primase: produceert primer voor DNA-polymerase; maakt korte RNA-primers voor leidende
streng met ribonucleoside trifosfaten
DNA-ligase: plakt okazaki-fragmenten aan elkaar
DNA-helicase: verbreekt H-bruggen door ATP-hydrolyse
Single-strand DNA-binding (SSB) proteins: zorgen voor
behoud van geopende DNA-ketens
Sliding ring: houdt bewegend DNA-polymerase bij het DNA
DNA-polymerase 1: vervangt RNA door DNA bij einde
Okazaki-fragment
Fouten herstellen
, - DNA-polymerase: betere affiniteit met correcte nucleotide dan met incorrecte nucleotide
- 3'5' proofreading exonuclease: verwijdert ongepaarde/mispaarde residuen aan 3' primer,
want transcriptie stopt als er een ongepaard 3'-OH uiteinde aan de primer zit
o RNA wordt gemaakt zonder primer; mutaties hebben geen lange-termijn effect
Initiatie en completatie van DNA-replicatie
Initiator-eiwitten: binden aan DNA op replication origin en verbreken
de H-bruggen
1. Tijdens menselijke celdeling zijn er 30000-50000
replicatieoorsprongen
2. Verschillende celtypen hebben verschillende soorten
oorsprongen
3. Net als in bacteriën worden replicatie-vorken gevormd in
paren die in tegengestelde richting bewegen in een replicatie-
bubbel
Telomerase repliceert chromosoom-uiteinden
Laatste RNA-primer van de volgende streng kan niet vervangen
worden door DNA, omdat er geen 3'-OH uiteinde is voor de repair
polymerase
- Telomerase is complementair aan de repeats van telomeren
(mensen: GGGTTA) en vult ze na celdeling weer aan bij de
parent strand, zodat replicatie tot het einde van de DNA-
streng kan plaatsvinden
- Hoeveelheid en activiteit van telomerase is afhankelijk van
het type cel beschermt tegen kanker
-
Er moet voorkomen worden dat telomerase hersteld wordt,
- Shelterin: beschermende chromosoomkap die de telomeren 'verbergt'
- T-loops, waardoor het uiteinde verborgen wordt en niet meer aan het uiteinde zit
Genen klonen in vitro met PCR
,Samenvatting video DNA-replicatie
Primer/template junction: startpunt van de DNA-replicatie
DNA-helicase: ringvormig hexomeer, omcirkelt een DNA-keten, waardoor de ketens uit elkaar
geduwd worden. Verschilt per helicase in welke richting ze bewegen.
- De strengen blijven uit elkaar door SSP's die binden aan de enkele ketens van de volgende
streng; bij de leidende streng gaat de replicatie zo snel dat dit niet nodig is.
Sliding DNA clamp: ringvormig molecuul die om dubbelstrengs DNA gaat. Ze binden aan de
achterkant van DNA-polymerase, waardoor DNA-polymerase aan de keten gehouden wordt. Ander
zouden ze na ongeveer 100 baseparen alweer loslaten van de DNA streng soort personal trainer
Sliding DNA clamp loader: door binding van ATP kan loader binden aan sliding DNA clamp en aan
DNA-keten.
, Vragen
a. Chromosomen zijn opgebouwd uit eiwitten (oa. histonen) en DNA. Het DNA bevat de genen
b. AATCGGATT Altijd van 5' naar 3'!
c. 24% T, 26% G, 26% C
d. T + G + C = 76%
e. Beide oude ketens komen in één van de twee dochtermoleculen. Beide nieuwe moleculen
bevatten dus 1 nieuwe en 1 oude keten. Dit is dus semi-conservatief, omdat er 1 keten
behouden blijft en 1 keten nieuw gevormd wordt per nieuw DNA-molecuul.
Conservatief zou zijn dat de oorspronkelijke dubbelstrengs keten blijft bestaan en een
nieuwe dubbelstrengs keten bestaande uit twee nieuwe ketens wordt gesynthetiseerd.
f. Bij prokaryoten is er één startpunt, bij eukaryoten zijn er heel veel startpunten (origins of
replications) op één DNA-molecuul
g. DNA-polymerase
h. Primase, DNA polymerase, nuclease om RNA af te breken, ligase
i. Dit RNA is een template voor de verlenging van de telomeren
Werkgroepopdrachten
Vraag 1
- Nee, de pijlen staan niet allemaal de goede kant uit getekend. Replicatie moet plaatsvinden
van 5' naar 3' en dit kan dus niet binnen een streng van richting veranderen
- 2 replicatievorken
- De replicatie van het DNA is begonnen bij replication origin. Dit is in het midden van de
opengebroken 'ovaal', tussen de 2 vorken
- Okazaki-fragmenten
- Ja, ligase is nuttig om de okazaki-fragmenten met elkaar te verbinden, zodat er één DNA-
streng gevormd wordt
Vraag 2
De eerste fosfaatgroep (fosfaatgroep aan de suikergroep), want deze blijft ook na het inbouwen van
de nucleotide nog aan de DNA-streng vastzitten. De tweede en derde fosfaatgroep worden
verwijdert. De energie die hierbij vrijkomt wordt gebruikt voor de binding van de eerste fosfaatgroep
aan de suikergroep van de volgende nucleotide.
Vraag 3
a. Radioactieve bouwsteen: 3H-labeled Thymidine (3H-T)
Niet-radioactieve bouwsteen: BrdU (bromodeoxyuridine)
b. Bij toevoeging van deze bouwstenen kan er nog steeds replicatie plaatsvinden, dit proces
wordt niet verstoord door de toegevoegde bouwstenen. Het gebruik van bouwstenen is
handig, omdat je monoklonale antilichamen kan gebruiken die binden aan deze bouwstenen.
Daardoor is het heel makkelijk om de bouwstenen op te sporen.
c. Alleen de cellen in de S-fase worden gelabeld. De S-fase is een vrij korte fase dus lang niet
alle cellen waren tijdens het kweken in de S-fase. De bouwstenen kunnen alleen in het DNA
komen tijdens DNA-replicatie, dus cellen in andere fases zullen niet gelabeld worden.
Vraag 4
Het gebeurt aan het uiteinde van een keten, dus het is exonuclease. De fosfaatgroep wordt aan de 5'-
kant toegevoegd, dus dan is het 3'-5' exonuclease.
Vraag 5
Aantal baseparen mens: 3 miljard = 3.000.000.000
- Lengte Okazaki-fragment: 100-200 bp
- Aantal Okazaki-fragmenten: 3 miljard /150 = 20.000.000 = 20 miljoen Okazaki-fragmenten
