Samenvatting PDNA
Les 1: Nucleotiden en nucleïnezuren (hoofdstuk 8)
Een nucleotide heeft 3 karakteristieke onderdelen: een base + suiker + fosfaatgroep. Een
molecuul zonder fosfaatgroep is een nucleoside.
• Verschil tussen suikers zijn de OH groepen: deoxy ribose (DNA) of ribose (RNA)
• DNA is niet vlak, maar bevindt zich in verschillende posities à ‘Puckered’
Nitrogeen bases: purine (Adenine en Guanine) en pyrimidine (Thymine, Cytosine en Uracil)
In cellen komen nucleotide voor met fosfaatgroepen op een andere positie. Deze gemodificeerde nucleotiden
hebben functies in o.a. het beschermen van DNA en het reguleren van bijvoorbeeld expressie van genen.
Fosfodiesterverbinding: binding tussen twee nucleotiden. Wordt gevormd
door polymerase en ligase activiteiten.
• Manier om (oligo-) nucleotidesequenties op te schrijven
Nucleotiden worden geabsorbeerd rond de 260 nm, maar er zit een klein verschil tussen de nucleotiden.
DNA-helix bestaat uit 2 complementaire strengen sequensen. Waarbij GC 3 H-bruggen kunnen worden en AT 2.
Verschillende DNA vormen:
• A-vorm: wordt gevormd in verschillende oplossingen, favoriet bij RNA
• B-vorm: de meest stabiele vorm van dubbel helix DNA onder fysiologische condities en dus de standaard
• Z-vorm: de backbone heeft een zigzag vorm, draait links om, deze vorm wordt gebruikt op het laboratorium.
Ontstaat bij hoge concentraties zout.
B-DNA: bestaat uit 2 groeven, de minor groove en de major groove.
• Functie groeven: eiwitten kunnen hier binden, DNA kan op bepaalde plekken niet
denatureren à stopt de eiwit-expressie.
Semi-conservatieve replicatie: elke streng dient als template voor de replicatie.
Restrictie-enzymen zijn gebaseerd op secundaire structuren zoals (±6 nucleotide lang):
- Palindroom: omgekeerde herhaling van sequentie aanwezig in complementaire streng,
zoals de naam HANNAH
- Mirrorrepeats: omgekeerde herhaling in eigen individuele streng
- Hairpin (bij RNA) of Cruciform (bij DNA): overeenkomst tussen strengen.
- Loop
Messenger RNA (mRNA): bevat eiwitcodering informatie
§ Startcodon: ATG en Stopcodon: UAA, UAG, UGA
§ Een cistron is een unit RNA dat codeert van 1 polypeptideketen oftewel 1 gen.
§ Prokaryoot mRNA is polycistronic en eukaryoot mRNA is mono-cistronic.
RNA secundaire structuren kunnen worden berekend met thermodynamica. 3D structuren hebben invloed op het
functioneren van het mRNA en de stabiliteit.
Bij hoge temperaturen wordt DNA gedenatureerd (bij PCR) en worden H-bruggen afgebroken. Als er een hoog
percentage G-C aanwezig is, wordt de smelttemperatuur hoger.
Hybridisatie: DNA-sequensen kunnen spontaan re-annealen en een helix vormen.
Door spontane reacties kunnen mutaties ontstaan en ophopen.
1. Deaminatie: het spontaan verlies van de exocyclic aminogroep
De deaminatie van cytosine tot Uracil vindt vaak plaats. Maar Uracil wordt herkend als ‘foreign’ DNA en
wordt verwijderd. Als dit niet zou gebeuren, dan zou na verlopen van tijd er alleen nog A-U bindingen zijn in
DNA.
2. Depurination: de base wordt losgekoppeld van de nucleotide door reactie met water.
, 3. Uv-straling: 2 dezelfde nucleotiden worden aan elkaar gelinkt door een covalente binding à kink in het DNA
Enzymatische reacties van nucleotiden:
• DNA-polymerase maakt aan een template strand een primer strand vast à helix
• De basis voor PCR.
- Tijdens annealen worden primers aan het DNA vastgemaakt. Tijdens de synthese wordt er door
DNA-polymerase verder gewerkt vanaf de primers.
Volgordebepaling van DNA met Sanger Sequencing:
§ Door naast dNTP’s toe te voegen worden ook ddNTP’s
toegevoegd. Het template kan niet verder worden aangevuld als er
een ddNTP aan vast zit.
§ Hierdoor ontstaan er verschillende
fragmenten met elk een andere lengte. Maar
uiteindelijk is elke nucleotide wel een keer
vervangen voor een ddNTP.
§ Door vervolgens de samples per
nucleotide soort op de gel te plaatsen kan de
volgorde van de sequensen worden bepaald.
Tegenwoordig wordt er
gebruik gemaakt van
dyes à next-
generation sequencing.
Een andere next-generation sequencing techniek maakt gebruik van 1
mix, waarbij elke ddNTP een eigen label (fluorescentie) heeft. Hierbij
wordt dus geen gebruik gemaakt van verschillende laantjes of
gescheiden reacties.
Pyrosequencing: hierbij gaan ss DNA aan een colloïd binden en worden
opgelicht met een bepaalde fluorescentie, afhankelijk van het dNTP.
Nucleotide houden energie vast, de meest bekende vorm is ATP
(adenine trifosfaat), maar ook UTP, GTP en CTP. Deze energie kan
gebruikt worden tijdens synthese reacties.
Adenine nucleotiden zijn componenten in verschillende enzym cofactoren, waaronder Co-enzym A, NAD+ en FAD.
Regulatory/signalling moleculen bevatten een nucleotide die signalen doorgeeft in de cel.
Les 2: Expressiesystemen, PCR en tags (hoofdstuk 9 en 28)
Het kloneren van DNA verloopt over het algemeen als volg (genetic engineering):
1. Het verkrijgen van het DNA-segment dat gekloneerd wordt, m.b.v. restrictie-enzymen
2. Selecteren van een klein molecuul DNA dat in staat is om autonoom te repliceren. à cloning vector
3. Samenvoegen van DNA-fragmenten met bv ligase, het ontstane DNA heet recombinant-DNA.
4. Het plaatsen van recombinant-DNA in een host/cel. De cel bevat de benodigde enzymatisch gereedschap
5. Het selecteren of identificeren van de cellen met het recombinant-DNA.
Een plasmide bestaat uit de volgende onderdelen:
§ Multiple cloning site: bevat veel polylinkers met unieke restrictie-sites.
§ Een selecteerbare marker, bv: Antibioticum resistentie: hiermee kunnen cellen geselecteerd worden. Dit
geeft ook een voordeel aan de bacteriën/cellen om het plasmide op te nemen.
- Screenable marker: een marker die fluoresceert (EGFP, mCherry)
§ Origin of replication: een sequence waar de replicatie van het plasmide begint. Deze is specifiek voor een
cel. Een shuttle vector bevat 2x een ORI, dus kan in meerdere host worden geplaatst.
Les 1: Nucleotiden en nucleïnezuren (hoofdstuk 8)
Een nucleotide heeft 3 karakteristieke onderdelen: een base + suiker + fosfaatgroep. Een
molecuul zonder fosfaatgroep is een nucleoside.
• Verschil tussen suikers zijn de OH groepen: deoxy ribose (DNA) of ribose (RNA)
• DNA is niet vlak, maar bevindt zich in verschillende posities à ‘Puckered’
Nitrogeen bases: purine (Adenine en Guanine) en pyrimidine (Thymine, Cytosine en Uracil)
In cellen komen nucleotide voor met fosfaatgroepen op een andere positie. Deze gemodificeerde nucleotiden
hebben functies in o.a. het beschermen van DNA en het reguleren van bijvoorbeeld expressie van genen.
Fosfodiesterverbinding: binding tussen twee nucleotiden. Wordt gevormd
door polymerase en ligase activiteiten.
• Manier om (oligo-) nucleotidesequenties op te schrijven
Nucleotiden worden geabsorbeerd rond de 260 nm, maar er zit een klein verschil tussen de nucleotiden.
DNA-helix bestaat uit 2 complementaire strengen sequensen. Waarbij GC 3 H-bruggen kunnen worden en AT 2.
Verschillende DNA vormen:
• A-vorm: wordt gevormd in verschillende oplossingen, favoriet bij RNA
• B-vorm: de meest stabiele vorm van dubbel helix DNA onder fysiologische condities en dus de standaard
• Z-vorm: de backbone heeft een zigzag vorm, draait links om, deze vorm wordt gebruikt op het laboratorium.
Ontstaat bij hoge concentraties zout.
B-DNA: bestaat uit 2 groeven, de minor groove en de major groove.
• Functie groeven: eiwitten kunnen hier binden, DNA kan op bepaalde plekken niet
denatureren à stopt de eiwit-expressie.
Semi-conservatieve replicatie: elke streng dient als template voor de replicatie.
Restrictie-enzymen zijn gebaseerd op secundaire structuren zoals (±6 nucleotide lang):
- Palindroom: omgekeerde herhaling van sequentie aanwezig in complementaire streng,
zoals de naam HANNAH
- Mirrorrepeats: omgekeerde herhaling in eigen individuele streng
- Hairpin (bij RNA) of Cruciform (bij DNA): overeenkomst tussen strengen.
- Loop
Messenger RNA (mRNA): bevat eiwitcodering informatie
§ Startcodon: ATG en Stopcodon: UAA, UAG, UGA
§ Een cistron is een unit RNA dat codeert van 1 polypeptideketen oftewel 1 gen.
§ Prokaryoot mRNA is polycistronic en eukaryoot mRNA is mono-cistronic.
RNA secundaire structuren kunnen worden berekend met thermodynamica. 3D structuren hebben invloed op het
functioneren van het mRNA en de stabiliteit.
Bij hoge temperaturen wordt DNA gedenatureerd (bij PCR) en worden H-bruggen afgebroken. Als er een hoog
percentage G-C aanwezig is, wordt de smelttemperatuur hoger.
Hybridisatie: DNA-sequensen kunnen spontaan re-annealen en een helix vormen.
Door spontane reacties kunnen mutaties ontstaan en ophopen.
1. Deaminatie: het spontaan verlies van de exocyclic aminogroep
De deaminatie van cytosine tot Uracil vindt vaak plaats. Maar Uracil wordt herkend als ‘foreign’ DNA en
wordt verwijderd. Als dit niet zou gebeuren, dan zou na verlopen van tijd er alleen nog A-U bindingen zijn in
DNA.
2. Depurination: de base wordt losgekoppeld van de nucleotide door reactie met water.
, 3. Uv-straling: 2 dezelfde nucleotiden worden aan elkaar gelinkt door een covalente binding à kink in het DNA
Enzymatische reacties van nucleotiden:
• DNA-polymerase maakt aan een template strand een primer strand vast à helix
• De basis voor PCR.
- Tijdens annealen worden primers aan het DNA vastgemaakt. Tijdens de synthese wordt er door
DNA-polymerase verder gewerkt vanaf de primers.
Volgordebepaling van DNA met Sanger Sequencing:
§ Door naast dNTP’s toe te voegen worden ook ddNTP’s
toegevoegd. Het template kan niet verder worden aangevuld als er
een ddNTP aan vast zit.
§ Hierdoor ontstaan er verschillende
fragmenten met elk een andere lengte. Maar
uiteindelijk is elke nucleotide wel een keer
vervangen voor een ddNTP.
§ Door vervolgens de samples per
nucleotide soort op de gel te plaatsen kan de
volgorde van de sequensen worden bepaald.
Tegenwoordig wordt er
gebruik gemaakt van
dyes à next-
generation sequencing.
Een andere next-generation sequencing techniek maakt gebruik van 1
mix, waarbij elke ddNTP een eigen label (fluorescentie) heeft. Hierbij
wordt dus geen gebruik gemaakt van verschillende laantjes of
gescheiden reacties.
Pyrosequencing: hierbij gaan ss DNA aan een colloïd binden en worden
opgelicht met een bepaalde fluorescentie, afhankelijk van het dNTP.
Nucleotide houden energie vast, de meest bekende vorm is ATP
(adenine trifosfaat), maar ook UTP, GTP en CTP. Deze energie kan
gebruikt worden tijdens synthese reacties.
Adenine nucleotiden zijn componenten in verschillende enzym cofactoren, waaronder Co-enzym A, NAD+ en FAD.
Regulatory/signalling moleculen bevatten een nucleotide die signalen doorgeeft in de cel.
Les 2: Expressiesystemen, PCR en tags (hoofdstuk 9 en 28)
Het kloneren van DNA verloopt over het algemeen als volg (genetic engineering):
1. Het verkrijgen van het DNA-segment dat gekloneerd wordt, m.b.v. restrictie-enzymen
2. Selecteren van een klein molecuul DNA dat in staat is om autonoom te repliceren. à cloning vector
3. Samenvoegen van DNA-fragmenten met bv ligase, het ontstane DNA heet recombinant-DNA.
4. Het plaatsen van recombinant-DNA in een host/cel. De cel bevat de benodigde enzymatisch gereedschap
5. Het selecteren of identificeren van de cellen met het recombinant-DNA.
Een plasmide bestaat uit de volgende onderdelen:
§ Multiple cloning site: bevat veel polylinkers met unieke restrictie-sites.
§ Een selecteerbare marker, bv: Antibioticum resistentie: hiermee kunnen cellen geselecteerd worden. Dit
geeft ook een voordeel aan de bacteriën/cellen om het plasmide op te nemen.
- Screenable marker: een marker die fluoresceert (EGFP, mCherry)
§ Origin of replication: een sequence waar de replicatie van het plasmide begint. Deze is specifiek voor een
cel. Een shuttle vector bevat 2x een ORI, dus kan in meerdere host worden geplaatst.
