hoofdstuk 21
Analyse en manipulatie van DNA
Eiwitten kunnen indirect worden bestudeerd en gemanipuleerd door deDNA
sequenties die ervoor coderen te bestuderen en manipuleren
Omdat de technieken voor DNA te isoleren, karakteriseren, manipuleren en tot
expressie brengen van gemodificeerde DNA meestal technisch minder moeilijk zijn
dan direct te werken met eiwitten doen celbiologen hun werk meestal met DNA
Gelelektroferese laat toe DNA te scheiden op basis van grootte
Om het antal en de lengte van DNA fragmenten te bepalen en individuele
fragmenten te isoleren voor verder onderzoek, moet een onderzoeker de
fragmenten van elkaar kunnen scheiden
=> de gekozen techniek voor dit doel is gelelektroferese datdezelfde methode is om
eiwitten en polypeptiden te scheiden (zie key technique hfst 7)
=> de procedure voor DNA is makkelijekr dan eiwitten omdat DNA moelculen
een negatieve lading hebben en daardoor niet behandeld moeten worden
met negatief geladen detergenten om hen tot de anode te laten bewegen
Kleine DNA fragmenten worden meestal gescheiden in polyacrylamide gels en
langere DNA fragmenten worden gescheiden in meer poreuze gellen gemaakt van
agarose, een polysacharide
Figuur: illustreetr de scheiding van DNA fragmenten van verschillende lengtes door
gel elektroferese
=> de monsters worden gemixt met een kleurstof zodat ze zichtbaar worden
gemaakt
Bv. Ethidium bromide (fluorescente stof)
=> dan worden ze in verschillende compartimenten gepalatst aan een einde van de
gel
=> een elektrische potentiaal wordt over de gel geplaatst waarbij de anode geplaatst
wordt aan de andere kant van de gel dan de monsters
=> omdat DNA negatief geladen is, bewegen de DNA fragmenten richting de anode
=> kleinere fragmenten (lager molecuulgewicht) bewegen relatief gemakkelijker door
de gel en migreren daarom sneller terwijl grote fragmenten langzamer bewegen
=> eindresultaat: een reeks DNA fragmenten die gescheiden zijn op basis van verschil
in grootte
, Standaard gel elektroferese kan niet worden gebruikt om verschillen in grootte van
zeer grote DNA moleculen (groter dan ongeveer 30kbp) op te lossen
=> migratie wordt beperkt door hun lengte
=> voor sommige toepassingen met zeer grote stukken DNA wordt een
gespecialiseerde vorm van gelektroferese toegepast, genaams pulsed field
elektroferese
=> deze techniek omvata gepulseerde elektrische velden
=> een langs de lange as van de gel en 2 extra
velden die gericht zijn om ongeveer 60° ten
opzichte van de lange as
=> de richting van het stroomveld verandert
afwisselend
=> hoe langer het DNA, hoe langer het duurt om het DNA te
herorienteren naar de nieuwe richting van het elektrsch veld terwijl
de pulsen worden aangelegd
=> efficiente groottescheiding van grote stukken DNA
=> DNA zo groot als kleine hele chromosomen an bacterien en schimmels kunnen op
deze manier worden gescheiden
Endonucleasen splitsen DNA moleculen op specifieke locaties
Veel DNA moleculen zijn te groot om intact te worden bestudeerd
=> door de ontdekking van restrictie-enzymen/ restrictie endonucleasen werd dit
veel gemakkelijker
=> eiwitten geisoleerd uit bacterien die vreemde DNA moleculen op specifieke
interne plaatsen knippen
Restrictie-enzymen helpen bacterien zichzelf te beschermen tegen invasie van
vreemde DNA moleculen, met name DNA uit bacteriofagen
Om z’n eigen DNA te beschermen tegen afbraak heeft de bacteriecel enzymen die
methylgroepen (-CH3) toevoegen aan specifieke nucleotiden die z’n eigen restrictie-
enzymen anders zouden herkennen
=> als ze eenmaal zijn gemethyleerd, worden de nucleotiden niet langer herkend
door de restrictie-enzymen , zodat het bacteriele DNA niet wort aangevallen
Het snijwerk van restricte-enzymen genereert een specifieke set DNA-stukken die
restrictiefragmenten worden genoemd
Elk restrictie-enzym splitst DNA enkel op plaatsen met specifieke
herkenningssequentie, genaamd restrictie site
=> is meestal 4 of 6 (maar kan ook 8 of meer zijn) nucleotiden lang
=> restrictie sites komen vaak genoeg voor in DNA te knippen in 100 tot 1000 bp
lange fragmenten
=> deze fragmenten zijn veel vatbaarder voor verdere manipultie dan die
lange fragmenten waaruit ze worden gegenereerd
Naamgeving:
bv. EcoR1 is het restrictie-enzym van de E.Coli
=> eerste restrictie-enzym geisoleerd uit de E.Coli stam R
Bv. HaeIII
=> derde restrictie-enzym geisoleerd uit hemophilus aegyptius
, Restrictie enzymen zijn specifiek voor dubbelstrengig DNA en splitsen beide strengen
=> sommige restrictie enzymen, zoals HaeIII, snijden beide strengen op
hetzelfde punt
=> restrictiefragmenten met blunt ends/ stompe uiteinden
gegenereerd
=> vele andere restrictie enzymen splitsen de 2 strengen op een gespreide
manier
=> korte, enkelstrengige staarten van beide fragmenten worden
gegenereerd
=> hebben sticky-ends of cohesieve uiteinden
=> deze enkelstrengige staart kan basenparen met eender welk ander
fragment dat door hetzelfde enzym werd gegenereerd
=> nuttig om recombinante DNA moleculen te creeren
De restrictie sites voor de meeste restrictie enzymen zijn palindromen
=> sequentie is in beide richtingen hetzelfde als het in de 5’-3’-richting wordt gelezen
=> het palindrome karakter is te wijten aan de dubbele rotatiesymmetrie
=> als de dubbelstrengige sequentie 180° wordt gedraaid, geeft het een
sequentie aan die hetzelfde is als voor de rotatie
De frequentie waarmee een bepaalde restrictie site waarschijnlijk in een DNA
molecuel zal voorkomen, kan statistisch worden voorspeld
Bv. in een DNA moelcule met gelijke hoeveelheden van de 4 basen kunnen we
voorspellen dat gemiddeld 1 keer per 256 (44) nucleotidenparen een herkennings site
met 4 nucleotidenparen zal voorkomen
=> terwijl de waarschijnlijke frequentie van 6 nucleotidensequentie eenmaal per
4096 (46) is
=> restrictie enzymen hebben daarom de neiging om DNA fragmenten te
knippen die typisch in lengte varieren van 100 tot 1000 nculeotidenparen
=> ongeveer de grootte van een gen
Omdat elk restrictie enzym slechts een enkele specifieke nucleotidesequetie splitst,
zal het een bepaald DNA molecule altijd op dezelfde voorspelbare manier knippen
=> worden zo reproduceerbare set van restrictiefragmenten gecreerd
=> deze eigenschap maakt restrictie enzymen krachtige hulpmiddelen voor het
generen van stukken DNA van makkelijk manipuleerbre groottes
Restrictiemapping kan DN karakteriseren
Een onderzoeker bepaalt de volgorde waarin een set restrictie enzymen is
geranschikt in een DNA molecule door het DNA met 2 of meer restrictie enzymen,
alleen en in combinatie, gevolg door een gelelektoferese om de grootte van de
resulterende DNA-fragmenten te bepalen
=> de groote kan worden gebruikt om een resctrictie map van het molecule te
construeren
=> geeft de locatie van alle restrictie sites in het oorspronkelijke DNA aan
, Figuur: werking restrictie mapping voro een eenvoudig DNA
molecuul die gesplitst wordt met de restrictie enzymen EcoRA en
HaeIII
=> elk individueel restrictie enzym knipt het DNA in 2 fragmenten
=> geeft aan dat het DNA 1 restrictie site heeft voor elk enzym
=> op basis van deze informatie kunnen 2 mogelijke restrictie maps worden
voorgesteld (A en B)
=> om te bepalen welk van de 2 kaarten correct is, moet een experiment
worden uitgevoerd waarbij het start DNA molecuul gelijktijdeig met ecoRA en
HaeIII wordt gesplitst
=> de grootte van de fragmenten die geproduceerd werden geeft aan
dat A juist is
het afleiden van de locatie van restrictie sites hangt van de vorm van het uitgangs
DNA af: lineair of ciculair
restrictie mapping kan ook worden gebruikt om menselijk DNA te analyseren als
onderdeel van het identificeren van specifieke kenmeren van het DNA van een
idividuele patient (of verdachte)
restrictie endonucleasen kunnen gemethyleerd DNA herkennen
DNA promotors kunnen worden gemethyleerd en dit beinvloed de kans dat een gen
wordt getranscripteerd
Bepaalde DNA sites worden op een weefselspecifieke manier gemethyleerd (in
sommige weefsels wel en in andere niet)
=> in het algemeen worden zo’n plaatsen gemethyleerd waar het gen inactief is maar
zijn ze niet gemethyleerd waar het gen actief is of potentieen actief
Sommige restrictie enzymen zijn gevoelig voor DNA-methylatie en
anderen niet
=> MspI splitst de herkenningsplaats -CCGG-ongeacht of de centrale C
gemethyleerd is of niet
=> HpaII knipt dezelfde restrictie site maar enkel als de centrale C niet
gemethyleerd is
Analyse en manipulatie van DNA
Eiwitten kunnen indirect worden bestudeerd en gemanipuleerd door deDNA
sequenties die ervoor coderen te bestuderen en manipuleren
Omdat de technieken voor DNA te isoleren, karakteriseren, manipuleren en tot
expressie brengen van gemodificeerde DNA meestal technisch minder moeilijk zijn
dan direct te werken met eiwitten doen celbiologen hun werk meestal met DNA
Gelelektroferese laat toe DNA te scheiden op basis van grootte
Om het antal en de lengte van DNA fragmenten te bepalen en individuele
fragmenten te isoleren voor verder onderzoek, moet een onderzoeker de
fragmenten van elkaar kunnen scheiden
=> de gekozen techniek voor dit doel is gelelektroferese datdezelfde methode is om
eiwitten en polypeptiden te scheiden (zie key technique hfst 7)
=> de procedure voor DNA is makkelijekr dan eiwitten omdat DNA moelculen
een negatieve lading hebben en daardoor niet behandeld moeten worden
met negatief geladen detergenten om hen tot de anode te laten bewegen
Kleine DNA fragmenten worden meestal gescheiden in polyacrylamide gels en
langere DNA fragmenten worden gescheiden in meer poreuze gellen gemaakt van
agarose, een polysacharide
Figuur: illustreetr de scheiding van DNA fragmenten van verschillende lengtes door
gel elektroferese
=> de monsters worden gemixt met een kleurstof zodat ze zichtbaar worden
gemaakt
Bv. Ethidium bromide (fluorescente stof)
=> dan worden ze in verschillende compartimenten gepalatst aan een einde van de
gel
=> een elektrische potentiaal wordt over de gel geplaatst waarbij de anode geplaatst
wordt aan de andere kant van de gel dan de monsters
=> omdat DNA negatief geladen is, bewegen de DNA fragmenten richting de anode
=> kleinere fragmenten (lager molecuulgewicht) bewegen relatief gemakkelijker door
de gel en migreren daarom sneller terwijl grote fragmenten langzamer bewegen
=> eindresultaat: een reeks DNA fragmenten die gescheiden zijn op basis van verschil
in grootte
, Standaard gel elektroferese kan niet worden gebruikt om verschillen in grootte van
zeer grote DNA moleculen (groter dan ongeveer 30kbp) op te lossen
=> migratie wordt beperkt door hun lengte
=> voor sommige toepassingen met zeer grote stukken DNA wordt een
gespecialiseerde vorm van gelektroferese toegepast, genaams pulsed field
elektroferese
=> deze techniek omvata gepulseerde elektrische velden
=> een langs de lange as van de gel en 2 extra
velden die gericht zijn om ongeveer 60° ten
opzichte van de lange as
=> de richting van het stroomveld verandert
afwisselend
=> hoe langer het DNA, hoe langer het duurt om het DNA te
herorienteren naar de nieuwe richting van het elektrsch veld terwijl
de pulsen worden aangelegd
=> efficiente groottescheiding van grote stukken DNA
=> DNA zo groot als kleine hele chromosomen an bacterien en schimmels kunnen op
deze manier worden gescheiden
Endonucleasen splitsen DNA moleculen op specifieke locaties
Veel DNA moleculen zijn te groot om intact te worden bestudeerd
=> door de ontdekking van restrictie-enzymen/ restrictie endonucleasen werd dit
veel gemakkelijker
=> eiwitten geisoleerd uit bacterien die vreemde DNA moleculen op specifieke
interne plaatsen knippen
Restrictie-enzymen helpen bacterien zichzelf te beschermen tegen invasie van
vreemde DNA moleculen, met name DNA uit bacteriofagen
Om z’n eigen DNA te beschermen tegen afbraak heeft de bacteriecel enzymen die
methylgroepen (-CH3) toevoegen aan specifieke nucleotiden die z’n eigen restrictie-
enzymen anders zouden herkennen
=> als ze eenmaal zijn gemethyleerd, worden de nucleotiden niet langer herkend
door de restrictie-enzymen , zodat het bacteriele DNA niet wort aangevallen
Het snijwerk van restricte-enzymen genereert een specifieke set DNA-stukken die
restrictiefragmenten worden genoemd
Elk restrictie-enzym splitst DNA enkel op plaatsen met specifieke
herkenningssequentie, genaamd restrictie site
=> is meestal 4 of 6 (maar kan ook 8 of meer zijn) nucleotiden lang
=> restrictie sites komen vaak genoeg voor in DNA te knippen in 100 tot 1000 bp
lange fragmenten
=> deze fragmenten zijn veel vatbaarder voor verdere manipultie dan die
lange fragmenten waaruit ze worden gegenereerd
Naamgeving:
bv. EcoR1 is het restrictie-enzym van de E.Coli
=> eerste restrictie-enzym geisoleerd uit de E.Coli stam R
Bv. HaeIII
=> derde restrictie-enzym geisoleerd uit hemophilus aegyptius
, Restrictie enzymen zijn specifiek voor dubbelstrengig DNA en splitsen beide strengen
=> sommige restrictie enzymen, zoals HaeIII, snijden beide strengen op
hetzelfde punt
=> restrictiefragmenten met blunt ends/ stompe uiteinden
gegenereerd
=> vele andere restrictie enzymen splitsen de 2 strengen op een gespreide
manier
=> korte, enkelstrengige staarten van beide fragmenten worden
gegenereerd
=> hebben sticky-ends of cohesieve uiteinden
=> deze enkelstrengige staart kan basenparen met eender welk ander
fragment dat door hetzelfde enzym werd gegenereerd
=> nuttig om recombinante DNA moleculen te creeren
De restrictie sites voor de meeste restrictie enzymen zijn palindromen
=> sequentie is in beide richtingen hetzelfde als het in de 5’-3’-richting wordt gelezen
=> het palindrome karakter is te wijten aan de dubbele rotatiesymmetrie
=> als de dubbelstrengige sequentie 180° wordt gedraaid, geeft het een
sequentie aan die hetzelfde is als voor de rotatie
De frequentie waarmee een bepaalde restrictie site waarschijnlijk in een DNA
molecuel zal voorkomen, kan statistisch worden voorspeld
Bv. in een DNA moelcule met gelijke hoeveelheden van de 4 basen kunnen we
voorspellen dat gemiddeld 1 keer per 256 (44) nucleotidenparen een herkennings site
met 4 nucleotidenparen zal voorkomen
=> terwijl de waarschijnlijke frequentie van 6 nucleotidensequentie eenmaal per
4096 (46) is
=> restrictie enzymen hebben daarom de neiging om DNA fragmenten te
knippen die typisch in lengte varieren van 100 tot 1000 nculeotidenparen
=> ongeveer de grootte van een gen
Omdat elk restrictie enzym slechts een enkele specifieke nucleotidesequetie splitst,
zal het een bepaald DNA molecule altijd op dezelfde voorspelbare manier knippen
=> worden zo reproduceerbare set van restrictiefragmenten gecreerd
=> deze eigenschap maakt restrictie enzymen krachtige hulpmiddelen voor het
generen van stukken DNA van makkelijk manipuleerbre groottes
Restrictiemapping kan DN karakteriseren
Een onderzoeker bepaalt de volgorde waarin een set restrictie enzymen is
geranschikt in een DNA molecule door het DNA met 2 of meer restrictie enzymen,
alleen en in combinatie, gevolg door een gelelektoferese om de grootte van de
resulterende DNA-fragmenten te bepalen
=> de groote kan worden gebruikt om een resctrictie map van het molecule te
construeren
=> geeft de locatie van alle restrictie sites in het oorspronkelijke DNA aan
, Figuur: werking restrictie mapping voro een eenvoudig DNA
molecuul die gesplitst wordt met de restrictie enzymen EcoRA en
HaeIII
=> elk individueel restrictie enzym knipt het DNA in 2 fragmenten
=> geeft aan dat het DNA 1 restrictie site heeft voor elk enzym
=> op basis van deze informatie kunnen 2 mogelijke restrictie maps worden
voorgesteld (A en B)
=> om te bepalen welk van de 2 kaarten correct is, moet een experiment
worden uitgevoerd waarbij het start DNA molecuul gelijktijdeig met ecoRA en
HaeIII wordt gesplitst
=> de grootte van de fragmenten die geproduceerd werden geeft aan
dat A juist is
het afleiden van de locatie van restrictie sites hangt van de vorm van het uitgangs
DNA af: lineair of ciculair
restrictie mapping kan ook worden gebruikt om menselijk DNA te analyseren als
onderdeel van het identificeren van specifieke kenmeren van het DNA van een
idividuele patient (of verdachte)
restrictie endonucleasen kunnen gemethyleerd DNA herkennen
DNA promotors kunnen worden gemethyleerd en dit beinvloed de kans dat een gen
wordt getranscripteerd
Bepaalde DNA sites worden op een weefselspecifieke manier gemethyleerd (in
sommige weefsels wel en in andere niet)
=> in het algemeen worden zo’n plaatsen gemethyleerd waar het gen inactief is maar
zijn ze niet gemethyleerd waar het gen actief is of potentieen actief
Sommige restrictie enzymen zijn gevoelig voor DNA-methylatie en
anderen niet
=> MspI splitst de herkenningsplaats -CCGG-ongeacht of de centrale C
gemethyleerd is of niet
=> HpaII knipt dezelfde restrictie site maar enkel als de centrale C niet
gemethyleerd is
