Hoofdstuk 17
DNA-replicatie
Wanneer cellen groeien en delen zijn de nieuw gevormde dochtercellen meestal
genetische duplicaten van de ouderscel die dezelfde (of vrijwel dezelfde) DNA-
sequenties bevat
=> de genetische informatie in de oudercel moet worden gedupliceerd en zorgvuldig
verdeeld worden over de dochtercellen tijdens het delingsproces
Het delingsproces omvat 2 overlappende gebeurtenissen
=> eerst deelt de kern en daarna het cytoplasma
=> deling van de kern = mitose
=> deling van het cytoplasma = cytokinese
Het begin van de mitose wordt gekenmerkt door condensatie (oprollen en vouwen)
van chromatine tot chromosomen
=> omdat de. RNA-replicatie al heeft plaatsgebonden bestaat elke chromsoom uit 2
kopieen die aan elkaar vastzitten tot de cel zich deelt
=> zolang ze gehecht blijven worden ze zusterchromatiden genoemd
Naarmate de chromatiden zichtbaar worden breekt de nucleaire envelop in
fragmenten
Mitotische spoel met microtubili leidt het scheiden van de zusterchromatiden-nu elk
een volwaardig chromosoom-naar de tegenovergestelde uiteinden van de cel
=> tegen deze tijd is meestal de cytokinese al begonnen en wordt een nieuwe
nucleaire envelop gevormd rond de 2 setten dochterchromosomen en de celdeling is
compleet
DNA-synthese gebeurt tijdens de S-fase
Ceclcyclus: interfase + M-fase
=> De celdeling zelf (M-fase) gebeurt in een dier in minder dan een uur
=> de cellen zitten het meeste van hun tijd tussen 2 delingen
=> deze periode wordt de interfase genoemd
Interfase: G1 + S + G2
=> S-fase: de hoeveelheid DNA verdubbeld tijdens deze specifieke periode
van de interfase
=> G1-fase: een tijdsverschil die de S-fase van de voorafgaande M-fase scheidt
=> G2-fase: een tijdsverschil die het einde van de S-fase en het begin van de volgende
M-fase scheidt
,DNA replicatie is semiconservatief
De onderliggende mechanismen voor DNA-replicatie hangen cruciaal af van de
dubbele helix structuur van DNA zelf
Watson en Crick dachten dat een van de 2 strengen van elke nieuw gevormde DNA-
molecule afgeleid is van de ouderlijke molecule waaruit de nieuwe streng is
gesynthetiseerd
=> wordt semiconservatieve replicatie genoemd
=> omdat de helft van de ouderlijke moleculen behouden wordt door elke
dochtermolecule
Figuur: er zijn 3 mechanismen denkbaar over hoe DNA
gerepliceerd zou worden
=> Conservatieve model
=> de helix van het ouderlijke Dna blijft intact en er
wordt een gehele nieuwe kopie gemaakt
=> dispersieve model
=> elke streng van beide dochtercellen bevat een mengsel van oude en nieuw
gesynthetiseerde segmenten
Bewijs van hoe de replicatie gebeurde
=> werd gebruik gemaakt van 2 isotopische vormen van stikstof: 14N en 15N om nieuw
gesynthetiseerde DNA-strengen te onderscheiden van de oude
=> Bacteriele cellen werden vele generaties gekweekt in een medium dat 15N-
gelabelde ammoniumchloriden bevatten om deze zware maar niet
radioactieve isotoop van stikstof in hun DNA-moleculen op te nemen
=> de cellen die 15N-gemerkt DNA bevatten werden overgebracht naar een
groeimedium dat de normale lichte isotoop van stikstof bevat: 14N
=> alle nieuw-gesynthetiseerde DNA-strengen hadden 14N ingebouwd
en alle oude strengen hadden 15N ingebouwd
=> onderscheid tussen de 2 werd gemaakt door evenwicht
dichtheidscentrifuge (omdat 15N dichter is dan 14N)
=> voor DNA-analyse wordt bij evenwichtsdichtheids-centrifuge vaak
cesiumchloride gebruikt (CsCl)
=> zwaar metaalzout dat oplossingen met een zeer hoge
dichtheid vormt
=> het DNA dat geanalyseerd wordt, wordt gemengd met een oplossing van
CsCl en vervolgens met een hoge snelheid gecentrifugeerd
=> het verschil in dichtheid zorgt ervoor dat dat ze elk op een andere
positie in de gradient komen te zitten
, => resultaten: na een replicatiecyclus was er 1 band van DNA waarvan de dichtheid
precies tussen die van 14N-DNA en 15N-DNA lag
=> er was geen band te zien bij de dichtheid van het zwaar DNA
=> het ouder-DNA is niet intact gebleven
=> er was geen band te zien bij de dichtheid van licht DNA
=> geen dochtermoleculen bestaan uitsluitend uit nieuw DNA
=> conclusie: een deel van elke dochter DNA-moleculen is nieuw
ingebracht en een deel was afgeleid van de moedermolecule
=> wanneer de half-ouderlijk en half-nieuwe DNA streng verwarmd
werd om de 2 strengen te scheiden vertoonde een streng de
dichtheid van 14N-streng en de andere van 15N-streng
=> semiconservatieve model klopt
=> wanneer het de tweede keer in de aanwezigheid van 14N deelde
zag men dat er ook een band kwam bij het licte DNA
Ander bewijs uit experimenten met eukaryoten
=> de delende cellen uit de worteltoppen van de tuinboom Vicia Faba werden kort
blootgesteld aan 3H-thymine en dan terug in een niet-radioactief medium gebracht
dat de microtubuli-remmer colchicine bevat
=> blokeert de mitose zodat bij elke ronde van DNA-replicatie, gedupliceerde
chromosomen (chromatiden) niet kunnen splitsen en dus aan elkaar blijven
hangen
=> zo kon men onderzoeken hoeveel replicatieronden er gebeurd
waren
=> om te bepalen welke stukken DNA de radioactieve nucleotiden bevatten werd
auto radiografie gebruikt
=> gebaseerd op gebruik van fotografische emulsie (lichtgevoelige laag) die op
het celmonster wordt aangebracht
=> een chemische reactie in de emulsie van zilvernitraat zorgt
voor het verschijnen van zwarte korrels dat te zien is op een
lichtmicroscoop op plaatsen waar radioactiviteit aanwezig is
=> resultaat:
=> na de eerste replicatie (was 3H-thymine aanwezig) bevatte elke
chromatine van elk chromosoom radioactiviteit
=> na de volgende replicatie (waar geen 3H-thymine aanwezig is) was er
maar 1 van elk paar chromatiden radioactief
=> uitzondering op de chromatideuitwisseling tijdens
recombinatie
=> conclusie: semiconservatief model klopt
, DNA replicatie is gewoonlijk bidirectionaal
De werking en de moleculen die gebruikt worden bij Dna-replicatie zijn vergelijkbaar
in bacterien en eukaryote cellen
=> is een fundamenteel proces
=> een proces dat vroeg in de evolutie van het leven moet zijn ontstaan
Figuur 1: de 2 Y-vormige structuren aangeduid door de pijlen stellen de
plaasten voor waar DNA gerepiceerd wordt
=> deze ‘replication forks’: replicatievorken worden gecreerd door een
replicatiemechanisme dat op een enkel punt in het DNA begint en op een
birectionele manier verder gaat
=> er zijn 2 replicatievorken gemaakt die in de tegengestelde richting van de
oorsprong bewegen waarbij ze de helix ontvouwen en beide strengen
kopieren terwijl ze verder gaan
Figuur 2: voor circulair DNA wordt dit proces soms theta replicatie genoemd
=> vindt niet enkel plaats in bacterien maar ook in het circulaire DNA van
mitochondria, chloroplasten, plasmiden en sommige virussen
=> aan het einde blijven de 2 resulterende Dna-cirkels verbonden
=> topoisomerase is nodig om deze van elkaar los te koppelen
Figuur 3: laat zien hoe de gebeurtenissen zich verhouden tot de deling van
bacterien die enkel een circulair chromosoom bevatten
=> hier binden 2 kopieen van het replicerende chromosoom aan het
plasmamembraan met hun replicatie oorsprong
=> terwijl de cel groeit als voorbereiding op celdeling wordt nieuw
plasmammebraan toegevoegd aan het gebied tussen deze
chromosoombevestigingsplaatsen
=> de 2 chromosomen worden naar tegenovergestelde uiteinden van
de cel geduwd
=> wanneer de DNA-replicatie voltooid is en de cel in grootte is verdubbeld, verdeelt
een binaire splijting de cel in het midden en scheidt de 2 chromosomen in 2
dochtercellen
figuur 4: replicatie van lineair DNA wordt geinitieerd op
meerder plaatsen
=> meerdere replicatie-eenheden worden replicons
genoemd
=> nadat de Dna-synthese geinitieerd is beginnen 2
replicatievorken DNA in tegengestelde richting, weg van
de oorsprong, te synthetiseren
=> er ontstaan replicatiebellen die in grootte groeien naarmate de replicatie
vordert
=> wanneer een groeiende replicatiebel van een replicon de replicatiebel van een
aangrenzend replicon tegenkomt wordt het DNA dat door de 2 replicons
gesynthetiseerd werd samengevoegd
=> DNA dat is gesynthetiseerd op talloze replicatieplaatsen wordt uiteindelijk
aan elkaar gekoppeld om 2 dubbelstrengige dochtermoleculen te vormen die
lek zijn samengesteld uit een ouderstreng en 1 nieuwe streng
DNA-replicatie
Wanneer cellen groeien en delen zijn de nieuw gevormde dochtercellen meestal
genetische duplicaten van de ouderscel die dezelfde (of vrijwel dezelfde) DNA-
sequenties bevat
=> de genetische informatie in de oudercel moet worden gedupliceerd en zorgvuldig
verdeeld worden over de dochtercellen tijdens het delingsproces
Het delingsproces omvat 2 overlappende gebeurtenissen
=> eerst deelt de kern en daarna het cytoplasma
=> deling van de kern = mitose
=> deling van het cytoplasma = cytokinese
Het begin van de mitose wordt gekenmerkt door condensatie (oprollen en vouwen)
van chromatine tot chromosomen
=> omdat de. RNA-replicatie al heeft plaatsgebonden bestaat elke chromsoom uit 2
kopieen die aan elkaar vastzitten tot de cel zich deelt
=> zolang ze gehecht blijven worden ze zusterchromatiden genoemd
Naarmate de chromatiden zichtbaar worden breekt de nucleaire envelop in
fragmenten
Mitotische spoel met microtubili leidt het scheiden van de zusterchromatiden-nu elk
een volwaardig chromosoom-naar de tegenovergestelde uiteinden van de cel
=> tegen deze tijd is meestal de cytokinese al begonnen en wordt een nieuwe
nucleaire envelop gevormd rond de 2 setten dochterchromosomen en de celdeling is
compleet
DNA-synthese gebeurt tijdens de S-fase
Ceclcyclus: interfase + M-fase
=> De celdeling zelf (M-fase) gebeurt in een dier in minder dan een uur
=> de cellen zitten het meeste van hun tijd tussen 2 delingen
=> deze periode wordt de interfase genoemd
Interfase: G1 + S + G2
=> S-fase: de hoeveelheid DNA verdubbeld tijdens deze specifieke periode
van de interfase
=> G1-fase: een tijdsverschil die de S-fase van de voorafgaande M-fase scheidt
=> G2-fase: een tijdsverschil die het einde van de S-fase en het begin van de volgende
M-fase scheidt
,DNA replicatie is semiconservatief
De onderliggende mechanismen voor DNA-replicatie hangen cruciaal af van de
dubbele helix structuur van DNA zelf
Watson en Crick dachten dat een van de 2 strengen van elke nieuw gevormde DNA-
molecule afgeleid is van de ouderlijke molecule waaruit de nieuwe streng is
gesynthetiseerd
=> wordt semiconservatieve replicatie genoemd
=> omdat de helft van de ouderlijke moleculen behouden wordt door elke
dochtermolecule
Figuur: er zijn 3 mechanismen denkbaar over hoe DNA
gerepliceerd zou worden
=> Conservatieve model
=> de helix van het ouderlijke Dna blijft intact en er
wordt een gehele nieuwe kopie gemaakt
=> dispersieve model
=> elke streng van beide dochtercellen bevat een mengsel van oude en nieuw
gesynthetiseerde segmenten
Bewijs van hoe de replicatie gebeurde
=> werd gebruik gemaakt van 2 isotopische vormen van stikstof: 14N en 15N om nieuw
gesynthetiseerde DNA-strengen te onderscheiden van de oude
=> Bacteriele cellen werden vele generaties gekweekt in een medium dat 15N-
gelabelde ammoniumchloriden bevatten om deze zware maar niet
radioactieve isotoop van stikstof in hun DNA-moleculen op te nemen
=> de cellen die 15N-gemerkt DNA bevatten werden overgebracht naar een
groeimedium dat de normale lichte isotoop van stikstof bevat: 14N
=> alle nieuw-gesynthetiseerde DNA-strengen hadden 14N ingebouwd
en alle oude strengen hadden 15N ingebouwd
=> onderscheid tussen de 2 werd gemaakt door evenwicht
dichtheidscentrifuge (omdat 15N dichter is dan 14N)
=> voor DNA-analyse wordt bij evenwichtsdichtheids-centrifuge vaak
cesiumchloride gebruikt (CsCl)
=> zwaar metaalzout dat oplossingen met een zeer hoge
dichtheid vormt
=> het DNA dat geanalyseerd wordt, wordt gemengd met een oplossing van
CsCl en vervolgens met een hoge snelheid gecentrifugeerd
=> het verschil in dichtheid zorgt ervoor dat dat ze elk op een andere
positie in de gradient komen te zitten
, => resultaten: na een replicatiecyclus was er 1 band van DNA waarvan de dichtheid
precies tussen die van 14N-DNA en 15N-DNA lag
=> er was geen band te zien bij de dichtheid van het zwaar DNA
=> het ouder-DNA is niet intact gebleven
=> er was geen band te zien bij de dichtheid van licht DNA
=> geen dochtermoleculen bestaan uitsluitend uit nieuw DNA
=> conclusie: een deel van elke dochter DNA-moleculen is nieuw
ingebracht en een deel was afgeleid van de moedermolecule
=> wanneer de half-ouderlijk en half-nieuwe DNA streng verwarmd
werd om de 2 strengen te scheiden vertoonde een streng de
dichtheid van 14N-streng en de andere van 15N-streng
=> semiconservatieve model klopt
=> wanneer het de tweede keer in de aanwezigheid van 14N deelde
zag men dat er ook een band kwam bij het licte DNA
Ander bewijs uit experimenten met eukaryoten
=> de delende cellen uit de worteltoppen van de tuinboom Vicia Faba werden kort
blootgesteld aan 3H-thymine en dan terug in een niet-radioactief medium gebracht
dat de microtubuli-remmer colchicine bevat
=> blokeert de mitose zodat bij elke ronde van DNA-replicatie, gedupliceerde
chromosomen (chromatiden) niet kunnen splitsen en dus aan elkaar blijven
hangen
=> zo kon men onderzoeken hoeveel replicatieronden er gebeurd
waren
=> om te bepalen welke stukken DNA de radioactieve nucleotiden bevatten werd
auto radiografie gebruikt
=> gebaseerd op gebruik van fotografische emulsie (lichtgevoelige laag) die op
het celmonster wordt aangebracht
=> een chemische reactie in de emulsie van zilvernitraat zorgt
voor het verschijnen van zwarte korrels dat te zien is op een
lichtmicroscoop op plaatsen waar radioactiviteit aanwezig is
=> resultaat:
=> na de eerste replicatie (was 3H-thymine aanwezig) bevatte elke
chromatine van elk chromosoom radioactiviteit
=> na de volgende replicatie (waar geen 3H-thymine aanwezig is) was er
maar 1 van elk paar chromatiden radioactief
=> uitzondering op de chromatideuitwisseling tijdens
recombinatie
=> conclusie: semiconservatief model klopt
, DNA replicatie is gewoonlijk bidirectionaal
De werking en de moleculen die gebruikt worden bij Dna-replicatie zijn vergelijkbaar
in bacterien en eukaryote cellen
=> is een fundamenteel proces
=> een proces dat vroeg in de evolutie van het leven moet zijn ontstaan
Figuur 1: de 2 Y-vormige structuren aangeduid door de pijlen stellen de
plaasten voor waar DNA gerepiceerd wordt
=> deze ‘replication forks’: replicatievorken worden gecreerd door een
replicatiemechanisme dat op een enkel punt in het DNA begint en op een
birectionele manier verder gaat
=> er zijn 2 replicatievorken gemaakt die in de tegengestelde richting van de
oorsprong bewegen waarbij ze de helix ontvouwen en beide strengen
kopieren terwijl ze verder gaan
Figuur 2: voor circulair DNA wordt dit proces soms theta replicatie genoemd
=> vindt niet enkel plaats in bacterien maar ook in het circulaire DNA van
mitochondria, chloroplasten, plasmiden en sommige virussen
=> aan het einde blijven de 2 resulterende Dna-cirkels verbonden
=> topoisomerase is nodig om deze van elkaar los te koppelen
Figuur 3: laat zien hoe de gebeurtenissen zich verhouden tot de deling van
bacterien die enkel een circulair chromosoom bevatten
=> hier binden 2 kopieen van het replicerende chromosoom aan het
plasmamembraan met hun replicatie oorsprong
=> terwijl de cel groeit als voorbereiding op celdeling wordt nieuw
plasmammebraan toegevoegd aan het gebied tussen deze
chromosoombevestigingsplaatsen
=> de 2 chromosomen worden naar tegenovergestelde uiteinden van
de cel geduwd
=> wanneer de DNA-replicatie voltooid is en de cel in grootte is verdubbeld, verdeelt
een binaire splijting de cel in het midden en scheidt de 2 chromosomen in 2
dochtercellen
figuur 4: replicatie van lineair DNA wordt geinitieerd op
meerder plaatsen
=> meerdere replicatie-eenheden worden replicons
genoemd
=> nadat de Dna-synthese geinitieerd is beginnen 2
replicatievorken DNA in tegengestelde richting, weg van
de oorsprong, te synthetiseren
=> er ontstaan replicatiebellen die in grootte groeien naarmate de replicatie
vordert
=> wanneer een groeiende replicatiebel van een replicon de replicatiebel van een
aangrenzend replicon tegenkomt wordt het DNA dat door de 2 replicons
gesynthetiseerd werd samengevoegd
=> DNA dat is gesynthetiseerd op talloze replicatieplaatsen wordt uiteindelijk
aan elkaar gekoppeld om 2 dubbelstrengige dochtermoleculen te vormen die
lek zijn samengesteld uit een ouderstreng en 1 nieuwe streng
