Biochemie samenvatting
Theorie
Cellen bestaan uit: vetten, nucleïnezuren, koolhydraten, eiwitten en kleine
moleculen.
Eiwitten zijn: enzymen, structuur (botten), mechanische werking (spieren),
sensoren (reuk), bescherming (immuunsysteem), etc.
Een eiwit = een polypeptide. Aan het ene einde van het eiwit zit een
aminogroep (N-terminus) en aan de andere een carboxylgroep (C-terminus).
Het vouwen van eiwitten wordt bepaald door interacties tussen aminozuren
onderling of met het oplosmiddel. De vouwing is bepalend voor de functie van het
eiwit.
De vouwing kan verstoord worden door: verandering in pH, zoutsterkte, temperatuur of de
aanwezigheid van ureum, guanidine, thiolreagentia, apolaire oplosmiddelen, zware metaalionen of
door oxidatie (met name cysteïne).
Eiwitzuivering bestaat uit:
- Homogeniseren & extractie
o Centrifugeren
Precipitatie (fractioneren)
Chromatografie: gelfiltratie (uitsluitingschromatografie),
ionenwisselaar, affiniteit, hydrofoob.
o Membraanfiltratie
o Vriesdrogen
Homogeniseren: openbreken van cellen d.m.v. osmotische shock (cellen barsten open), freeze/thaw,
enzymatisch indien celwand, potter Elvehjem/ dounchen, vermalen met zand/glaskorrels, French
press (cellen knappen kapot), blender, ultrasoon trillen.
Hierbij moet activiteitsverlies voorkomen worden door bijv. verandering is temperatuur of pH,
oxidatie of de aanwezigheid van zware metalen of vrijkomende proteasen.
Een membraangebonden eiwit moet worden gesolubiliseerd: eerste oplossen uit het membraan
door het gebruik van een geschikt detergens.
Soorten detergentia:
- Triton x-100, Tween en NP-40: milde detergentia. Non-ionic = geen eiwitdenaturatie.
- SDS en cholaat: sterke detergentia. Ionic – eiwitdenaturatie.
Centrifugeren: wordt gedaan om
- Precipitaten te verwijderen
- Specifieke cellen uit suspensies, celorganellen, eiwitcomplexen en membraanfragmenten te
isoleren.
- Met analytisch centrifugeren kan het Mw van de eiwitten bepaald worden.
Methoden van centrifugeren
- Differentiële: Bij wateroplosbare eiwitten worden de organellen opengebroken. Bij
membraaneiwitten wordt gesolubiliseerd. Bij deze vorm van centrifugeren worden de
componenten gescheiden in een supernatant en een pellet.
Theorie
Cellen bestaan uit: vetten, nucleïnezuren, koolhydraten, eiwitten en kleine
moleculen.
Eiwitten zijn: enzymen, structuur (botten), mechanische werking (spieren),
sensoren (reuk), bescherming (immuunsysteem), etc.
Een eiwit = een polypeptide. Aan het ene einde van het eiwit zit een
aminogroep (N-terminus) en aan de andere een carboxylgroep (C-terminus).
Het vouwen van eiwitten wordt bepaald door interacties tussen aminozuren
onderling of met het oplosmiddel. De vouwing is bepalend voor de functie van het
eiwit.
De vouwing kan verstoord worden door: verandering in pH, zoutsterkte, temperatuur of de
aanwezigheid van ureum, guanidine, thiolreagentia, apolaire oplosmiddelen, zware metaalionen of
door oxidatie (met name cysteïne).
Eiwitzuivering bestaat uit:
- Homogeniseren & extractie
o Centrifugeren
Precipitatie (fractioneren)
Chromatografie: gelfiltratie (uitsluitingschromatografie),
ionenwisselaar, affiniteit, hydrofoob.
o Membraanfiltratie
o Vriesdrogen
Homogeniseren: openbreken van cellen d.m.v. osmotische shock (cellen barsten open), freeze/thaw,
enzymatisch indien celwand, potter Elvehjem/ dounchen, vermalen met zand/glaskorrels, French
press (cellen knappen kapot), blender, ultrasoon trillen.
Hierbij moet activiteitsverlies voorkomen worden door bijv. verandering is temperatuur of pH,
oxidatie of de aanwezigheid van zware metalen of vrijkomende proteasen.
Een membraangebonden eiwit moet worden gesolubiliseerd: eerste oplossen uit het membraan
door het gebruik van een geschikt detergens.
Soorten detergentia:
- Triton x-100, Tween en NP-40: milde detergentia. Non-ionic = geen eiwitdenaturatie.
- SDS en cholaat: sterke detergentia. Ionic – eiwitdenaturatie.
Centrifugeren: wordt gedaan om
- Precipitaten te verwijderen
- Specifieke cellen uit suspensies, celorganellen, eiwitcomplexen en membraanfragmenten te
isoleren.
- Met analytisch centrifugeren kan het Mw van de eiwitten bepaald worden.
Methoden van centrifugeren
- Differentiële: Bij wateroplosbare eiwitten worden de organellen opengebroken. Bij
membraaneiwitten wordt gesolubiliseerd. Bij deze vorm van centrifugeren worden de
componenten gescheiden in een supernatant en een pellet.
