Examen geïntegreerd practicum
Gebruikte stoffen
0,9% Natriumchloride Gebruikt om de mond te spoelen, epitheelcellen te verzamelen en intact
(NaCl) te houden.
Lysisbuffer Breekt celmembranen af en zorgt voor het vrijmaken van DNA.
• 10 mM Tris • Buffer voor behouden van een stabiele pH.
pH 8,0 • Metaal chelator. Het inactiveert metaalafhankelijke enzymen,
• 10 mM EDTA bijvoorbeeld nucleases. Als gevolg wordt DNA beschermd.
pH 8,0 • Ionische sterkte van buffer oplossing tot stand brengen.
• 0,1M NaCl Stabilisatie van DNA en oplossen van celinhoud.
2% SDS Detergent die de plasmamembraan afbreekt en proteïnen denatureert.
Proteïnase K Breekt eiwitten af die het DNA kunnen contamineren.
Verzadigd NaCl Denaturatie van eiwitten en stabilisatie van het DNA.
Absolute ethanol Gebruikt om de watermantel rondom de het DNA te verbreken, zodat het
DNA zal neerslaan en geïsoleerd kan worden.
70% Ethanol Precipiteert DNA en verwijdert onzuiverheden.
TE-4 buffer Oplossen en bewaren van het gezuiverde DNA.
• 0,1mM EDTA • Metaal chelator.
10mM Tris HCl pH 7,5 Buffer voor behouden van stabiele pH.
Faag λ DNA Gebruikt om een ijklijn te maken om de stock concentratie van het faag λ
DNA te berekenen.
5X TBE (tris-boraat-
EDTA) buffer Hierin wordt de agarose voor de gels in opgelost.
• 27,5g Tris • Buffer voor behouden van stabiele pH.
• 54g Boorzuur • Inhibitor van vele enzymen.
20mL 0,5M EDTA Metaal chelator. Zie eerder.
pH8,3
Agarosegel DNA scheiding op basis van de grootte van de fragmenten.
• Agarose • Korrels die wanneer opgelost in TBE buffer een poreus medium
• TBE buffer vormen.
GelRedTM • Zie hierboven
DNA-intercalerende molecule, gebruikt voor visualisatie van DNA.
GelRedTM is mutageen, dus steeds Nitril handschoenen dragen.
10x SLM (sample Deze oplossing wordt gebruikt ter voorbereiding van het staal op de
loading mix) agarose-gelelektroforese.
• 0,5M EDTA • Metaal chelator. Zie eerder.
• 2,5mL 20% • Eliminatie van DNA-eiwit interacties door denaturatie van
SDS eiwitten.
• 50g sucrose • Verhoogt de dichtheid van het DNA zodat het tot op de bodem
0,125 g van het slotje zinkt.
broomfenolblauw pH Zorgt voor een blauwe kleuring van de stalen. Broomfenolblauw heeft een
7,5 negatieve lading en zal dus mee migreren met het DNA naar de positieve
pool. Het wordt gebruikt als merker om te zien waar de DNA stalen zich
ongeveer bevinden.
Lengtemerker Staal met gekende grootte van fragmenten en wordt als referentie
gebruikt om te bepalen hoe ver fragmenten van een bepaalde lengte
migreren in een agarosegel. Dit helpt dus bij het schatten van de grootte
van onbekende fragmenten.
PCR-buffer ( Creëert een gunstige omgeving voor Taq-polymerase, bij optimale pH en
kleurloos) ionenconcentraties. Voorziet nodige cofactoren voor enzymatische
reacties. Stabiliseert DNA fragmenten.
, Examen geïntegreerd practicum
PCR-buffer (groen) In deze buffer is al ladingsbuffer toegevoegd, waardoor het rechtstreeks
op de gel gezet kan worden. Deze ladingsbuffer wordt enkel gebruikt
indien na deze stap niet meer gekloneerd of gesequencet wordt.
dNTP’s Deoxynucleotide trifosfaat, stukjes nodig voor de verlenging van de DNA
keten.
MgCl2 Fungeert als cofactor voor Taq polymerase en zal hiervan de activiteit
verhogen. Ook faciliteert het de binding van primers en DNA template
streng.
Forward primer Complementair aan de antisense streng (3’→5’), zorgt voor kopiëring van
de antisense streng.
Reverse primer Complementair aan de sense streng (5’→3’), zorgt voor kopiëring van de
sense streng.
DNA Taq polymerase Enzym dat zorgt voor inbouwen van dNTP’s.
3M Natriumacetaat Wordt gebruikt in de PCR-cleaning. Natriumacetaat zal het PCR-product
neerslaan. Hierdoor kan het PCR-product gescheiden worden van de rest
van de producten.
Chemocompetente Bacteriën die vreemd genetisch materiaal kunnen opnemen door
bacteriën behandeling met een zoutoplossing en een hitte shock.
pUC19 controle Een lege vector die wordt gebruikt om de transformatie-efficiëntie te
vector bepalen.
SOC-medium (uit
Een groeimedium voor getransformeerde bacteriën. Bevat essentiële
TOPO kit Invitrogen)
voedingsstoffen waardoor het ingebouwd gen succesvol tot expressie kan
(Super Optimal broth
komen. Gebruikt om maximale transformatie-efficiëntie in E. coli te
with catabolite
bekomen.
repression)
Ampicilline Antibioticum dat bacteriën doodt, maar getransformeerde bacteriën niet,
aangezien deze een plasmide vector met een ampiciline-resistent gen
bevatten.
pUR™ 4-TOPO De T-tailed plasmide vector wordt gebruikt om het gen in de bacterie te
plasmide vector brengen.
zoutoplossing Efficiënter maken van de hitte shock.
X-gal X-galactose is het substraat van β-galactosidase. Het
wordt door het enzym geknipt met als producten
galactose en een blauwe kleurstof (X).
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside is een reagens
om de expressie van het Lac-operon te triggeren.
Vloeibaar LB medium Lysogeny Broth (LB) is een medium om bacteriën in
• 1g tryptone te laten groeien. Bij toevoeging van agarose wordt
• 0,5g een gel gevormd (LB agarplaat).
gistextract • Essentiële aminozuren en koolstofbron voor de groei van
1g NaCl bacteriën.
• Voorziet bacteriën van organische voedingsstoffen, zoals
bijvoorbeeld vitaminen.
Transport en osmotische balans.
Suspensie buffer
• 50mM tris- Brengt cellen in suspensie en voorziet optimale omstandigheden.
HCl • Zie eerder
• 10mM • Zie eerder
EDTA,pH 8.0 Het verwijderen van RNA.
2,5mg RNAse A
Lyse buffer Een buffer om cellen open te breken.
Gebruikte stoffen
0,9% Natriumchloride Gebruikt om de mond te spoelen, epitheelcellen te verzamelen en intact
(NaCl) te houden.
Lysisbuffer Breekt celmembranen af en zorgt voor het vrijmaken van DNA.
• 10 mM Tris • Buffer voor behouden van een stabiele pH.
pH 8,0 • Metaal chelator. Het inactiveert metaalafhankelijke enzymen,
• 10 mM EDTA bijvoorbeeld nucleases. Als gevolg wordt DNA beschermd.
pH 8,0 • Ionische sterkte van buffer oplossing tot stand brengen.
• 0,1M NaCl Stabilisatie van DNA en oplossen van celinhoud.
2% SDS Detergent die de plasmamembraan afbreekt en proteïnen denatureert.
Proteïnase K Breekt eiwitten af die het DNA kunnen contamineren.
Verzadigd NaCl Denaturatie van eiwitten en stabilisatie van het DNA.
Absolute ethanol Gebruikt om de watermantel rondom de het DNA te verbreken, zodat het
DNA zal neerslaan en geïsoleerd kan worden.
70% Ethanol Precipiteert DNA en verwijdert onzuiverheden.
TE-4 buffer Oplossen en bewaren van het gezuiverde DNA.
• 0,1mM EDTA • Metaal chelator.
10mM Tris HCl pH 7,5 Buffer voor behouden van stabiele pH.
Faag λ DNA Gebruikt om een ijklijn te maken om de stock concentratie van het faag λ
DNA te berekenen.
5X TBE (tris-boraat-
EDTA) buffer Hierin wordt de agarose voor de gels in opgelost.
• 27,5g Tris • Buffer voor behouden van stabiele pH.
• 54g Boorzuur • Inhibitor van vele enzymen.
20mL 0,5M EDTA Metaal chelator. Zie eerder.
pH8,3
Agarosegel DNA scheiding op basis van de grootte van de fragmenten.
• Agarose • Korrels die wanneer opgelost in TBE buffer een poreus medium
• TBE buffer vormen.
GelRedTM • Zie hierboven
DNA-intercalerende molecule, gebruikt voor visualisatie van DNA.
GelRedTM is mutageen, dus steeds Nitril handschoenen dragen.
10x SLM (sample Deze oplossing wordt gebruikt ter voorbereiding van het staal op de
loading mix) agarose-gelelektroforese.
• 0,5M EDTA • Metaal chelator. Zie eerder.
• 2,5mL 20% • Eliminatie van DNA-eiwit interacties door denaturatie van
SDS eiwitten.
• 50g sucrose • Verhoogt de dichtheid van het DNA zodat het tot op de bodem
0,125 g van het slotje zinkt.
broomfenolblauw pH Zorgt voor een blauwe kleuring van de stalen. Broomfenolblauw heeft een
7,5 negatieve lading en zal dus mee migreren met het DNA naar de positieve
pool. Het wordt gebruikt als merker om te zien waar de DNA stalen zich
ongeveer bevinden.
Lengtemerker Staal met gekende grootte van fragmenten en wordt als referentie
gebruikt om te bepalen hoe ver fragmenten van een bepaalde lengte
migreren in een agarosegel. Dit helpt dus bij het schatten van de grootte
van onbekende fragmenten.
PCR-buffer ( Creëert een gunstige omgeving voor Taq-polymerase, bij optimale pH en
kleurloos) ionenconcentraties. Voorziet nodige cofactoren voor enzymatische
reacties. Stabiliseert DNA fragmenten.
, Examen geïntegreerd practicum
PCR-buffer (groen) In deze buffer is al ladingsbuffer toegevoegd, waardoor het rechtstreeks
op de gel gezet kan worden. Deze ladingsbuffer wordt enkel gebruikt
indien na deze stap niet meer gekloneerd of gesequencet wordt.
dNTP’s Deoxynucleotide trifosfaat, stukjes nodig voor de verlenging van de DNA
keten.
MgCl2 Fungeert als cofactor voor Taq polymerase en zal hiervan de activiteit
verhogen. Ook faciliteert het de binding van primers en DNA template
streng.
Forward primer Complementair aan de antisense streng (3’→5’), zorgt voor kopiëring van
de antisense streng.
Reverse primer Complementair aan de sense streng (5’→3’), zorgt voor kopiëring van de
sense streng.
DNA Taq polymerase Enzym dat zorgt voor inbouwen van dNTP’s.
3M Natriumacetaat Wordt gebruikt in de PCR-cleaning. Natriumacetaat zal het PCR-product
neerslaan. Hierdoor kan het PCR-product gescheiden worden van de rest
van de producten.
Chemocompetente Bacteriën die vreemd genetisch materiaal kunnen opnemen door
bacteriën behandeling met een zoutoplossing en een hitte shock.
pUC19 controle Een lege vector die wordt gebruikt om de transformatie-efficiëntie te
vector bepalen.
SOC-medium (uit
Een groeimedium voor getransformeerde bacteriën. Bevat essentiële
TOPO kit Invitrogen)
voedingsstoffen waardoor het ingebouwd gen succesvol tot expressie kan
(Super Optimal broth
komen. Gebruikt om maximale transformatie-efficiëntie in E. coli te
with catabolite
bekomen.
repression)
Ampicilline Antibioticum dat bacteriën doodt, maar getransformeerde bacteriën niet,
aangezien deze een plasmide vector met een ampiciline-resistent gen
bevatten.
pUR™ 4-TOPO De T-tailed plasmide vector wordt gebruikt om het gen in de bacterie te
plasmide vector brengen.
zoutoplossing Efficiënter maken van de hitte shock.
X-gal X-galactose is het substraat van β-galactosidase. Het
wordt door het enzym geknipt met als producten
galactose en een blauwe kleurstof (X).
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside is een reagens
om de expressie van het Lac-operon te triggeren.
Vloeibaar LB medium Lysogeny Broth (LB) is een medium om bacteriën in
• 1g tryptone te laten groeien. Bij toevoeging van agarose wordt
• 0,5g een gel gevormd (LB agarplaat).
gistextract • Essentiële aminozuren en koolstofbron voor de groei van
1g NaCl bacteriën.
• Voorziet bacteriën van organische voedingsstoffen, zoals
bijvoorbeeld vitaminen.
Transport en osmotische balans.
Suspensie buffer
• 50mM tris- Brengt cellen in suspensie en voorziet optimale omstandigheden.
HCl • Zie eerder
• 10mM • Zie eerder
EDTA,pH 8.0 Het verwijderen van RNA.
2,5mg RNAse A
Lyse buffer Een buffer om cellen open te breken.
