Samenvatting hoofdstuk 21 Becker's World of the Cell, Global Edition, ISBN: 9781292177694 Celbiologie 1 (E03Y0A)

H21: Moleculair biologische technieken in
de celbiologie
1. Analyseren en manipuleren van DNA
Gel elektroforese
= een techniek om DNA van elkaar te onderscheiden op basis van grootte
Nodig:
 restrictie-enzymen om DNA te knippen in verschillende grootten
 gel
o polyacrylamide voor kleine fragmenten
o agarose voor grote DNA fragmenten
 elektrisch veld
 buffer oplossing
 ethidium bromide om DNA te labelen (zichtbaar door bestraling via UV licht)
 DNA ladder: mengsel van DNA fragmenten van gekende lengte
Werking: DNA fragmenten migreren van de negatieve naar de positieve pool obv grootte:
hoe kleiner de fragmenten, hoe sneller de migratie

Pulsed-field elektroforese
= DNA fragmenten groter dan 30 kb die niet door poriën van agarose gel kunnen migreren
scheiden obv grootte
Nodig:
 één elektrisch veld langs de as vd gel
 twee bijhorende velden die op 60° van de as liggen
Werking: Richting van stroomveld verandert afwisselend. Hoe groter DNA, hoe trager het
duurt eerdat het DNA fragment juist is georiënteerd.

Restrictie endonucleasen
= Restrictie enzymen knippen beide strengen van dsDNA in restrictie fragmenten op
specifieke restrictie sequenties
Restrictie sites: vaak palindromisch, RS van 4 nt: kans op voorkomen 4 4en RS van 6 nt: kans
op voorkomen 46
Oorsprong RE:
 geisoleerd uit bacterien (naamgeving obv bacterie + romeins cijfer)
 verdediginsmechanisme van bacterie tegen bacteriofagen
 knippen viraal DNA uit hun eigen bacterieel DNA (knippen bacterieel DNA niet omdat
herkenningssite van bact DNA gemethyleerd is via methylasen)

, Werking : RE herkennen specifieke sequentie en knippen obv blunt ends (beide strengen op
zelfde plaats geknipt, geen overhang vb HaeIII) of sticky ends (strengen op andere plek
knippen, 5’ of 3’ overhang => kan baseparen vb EcoRI )
Nut:
 DNA knippen : normaal DNA te groot en complex om te bestuderen
 RE die sticky ends creëren: nut in recombinante DNA technologie
 nagaan of DNA gemethyleerd is en dus ook of gen (in)actief is (2 RE die zelfde
sequentie knippen ifv geen of wel methylering: vergelijken)

Restrictie mapping
= DNA behandelen met twee of meerdere restrictie enzymen en ze vervolgens rangschikken
op grootte door elektroforese (belangrijk: rekening houden of DNA circulair of lineair is)
Nut: beschrijft de locatie van alle restrictie sites in oorspronkelijk DNA + DNA identificeren

Southern blot analyse
= DNA fragmenten scheiden obv gel elektroforese, overbrengen naar membraan (blotten),
identificatie via probe hybridisatie en visualisatie
Nodig:
 radioactief gemerkte ‘probe’ (stuk enkelstrengig DNA of RNA dat radioactief of
fluorescent gemerkt wordt)
 RE
 Agarose
 Nylon of nitrosecellulair papier (membraan)
Werking:
1. Knippen van genomisch DNA met RE
2. Agarose gelelektroforese
3. Denaturatie van DNA (enkelstrengig maken: noodz voor hybridisatie)
4. Blotten: DNA wordt overgebracht op membraan
5. Hybridisatie: toevoegen van probe
6. Visualisatie van banden waar de probe gebonden is via Xray of UVlicht
Nut: specifieke DNA sequentie identificeren van een mengsel
Beperking: probe op voorhand kiezen

DNA klonen (recombinante DNA technologie)
= van 1 DNA molecule vele DNA moleculen maken

DNA klonen met RE en DNA ligase
= 1 DNA fragment maken van twee verschillende DNA fragmenten (verschillende
oorsprong), recombinaties die niet vrij in de natuur zouden voorkomen (ggo’s)
Nodig:
 eenzelfde RE
 twee DNA bronnen