Volledige samenvatting Moleculaire biologie - 1e bachelor Tandheelkunde

SAMENVATTING MOLECULAIRE
BIOLOGIE




1

,HFD 1: DNA-INLEIDING
INLEIDING
LEVEN
Voor de definitie moet je gebruik maken van verschillende factoren, apart zijn ze niet voldoende
 Afgescheiden geheel: afgescheiden van leefomgeving door celmembraan/ celwand, inhoud (vooral H,
O, C, N) verschillend van omgeving
 Samenstelling  biomolecules (bij levende moleculen  maar er zijn uitzonderingen, bv lijk)
 Beweging: kunnen op eigen kracht bewegen naar voedsel of energiebron (hoeft geen voortbewegen te
zijn; zie planten)
 Energieopname en -verbruik: noodzakelijk voor instandhouding van organisme
 Meeste energie geleverd door het zonlicht, wordt door de planten gebruikt bij de fotosynthese 
Planten vormen dan weer het voedsel van andere organismen
 Voortplanting: voortplanten door seksuele of aseksuele voortplanting via ontwikkeling van bevruchte of
onbevruchte eicellen, noodzakelijk om uitsterven te voorkomen
 Doorgeven van kenmerken
 Groei: evolutie en complexiteit van organisme tot volwassen stadium, zal sterven door ouderdom of
deling in dochterorganismen.
 Communicatie tussen soortgenoten en verschillende levensvormen
 Prikkels interpreteren: gegevens uit de omgeving verzamelen en reageren op bepaalde condities zoals
aan- of afwezigheid van een voedselbron, licht, gevaar, …

Moleculaire biologie = bestuderen van chemische processen zoals ze zich voortdoen in levende wezens 
leven is één opeenvolging van chemische, complexe reacties


WAARUIT BESTAAT EEN LEVENDE CEL?
 = Basisstructuur (kleinste deel) van levende organismen dat min of meer autonoom staat te overleven,
een eenheid afgescheiden van de omgeving met een zeer georganiseerde opbouw
 Wisselwerking tussen biomoleculen (proteïnen, lipiden, carbohydraten en nucleïnezuren)
 Zijn betrokken bij verschillende activiteiten en functies van de cel
 Informatie van de opbouw op een zeer gecontroleerde wijze tot expressie komen
 Geeft info door aan dochtercellen
 2 basistypen: prokaryoten en eukaryoten
 Bij eukaryoten is de cel opgedeeld door membranen, duidelijkst in de celkern (niet bij prokaryoten)
 Komen op niveau van biochemische processen vaak overeen
 (Menselijk lichaam bevat meer prokaryote cellen dan eukaryote (1,3x)  microbioom)


HISTORIE ERFELIJKHEIDSLEER
EIGENSCHAPPEN ZIJN ERFELIJK: DE GENEN
Genen = informatie bevattende elementen die karakteristieken van een individu bevatten, ook de soort
 Coderen voor erfelijke eigenschappen
 Voor het eerst gedefinieerde in studies van Mendel

In Mendels experiment werden lange erwten met korte erwten gekruist en deze gaven in de eerste generatie
uitsluitend lange erwten, pas in de tweede kwamen terug korte voor. Mendel kwam tot volgende
wetmatigheden:
 Waarneembare eigenschappen zijn terug te brengen tot
overerfbare eenheden
 Elke diploïde cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij
eventueel meerdere allelen mogelijk zijn (elke variant van het
gen)

2

, Genen zijn óf dominant versus recessief (homozygoot) óf intermediair (heterozygoot)


LINK TUSSEN GENEN EN BIOCHEMISCHE PROCESSEN DOOR GARROD
Garrod
 Link leggen tussen genen en biochemische processen via zeldzame aandoening alkaptonurie
 Uiteenlopende symptomen
 Bij baby’s kleurt de urine, na enige tijd blootgesteld aan lucht, zwart
 De eerste die voorstelde dat deze ziekte te wijten was aan defect gen  verklaarde waarom het bij de
ouders niet tot uiting kwam, ze hebben maar 1 kopij van het defectieve gen

Alkaptonurie
 Erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij één defect gen één defect enzym oplevert
 Urine heeft een hogere concentratie homogentisinezuur bevatte  dit moest normaal worden
afgebroken door een enzym (dit was dan defect bij alkaptonurie patiënten)
 Vormde de start van onderzoek naar moleculaire verklaring van erfelijkheid (eerder dan de mystieke
verklaringen van behekste families of erfzonden bv)


WELKE STOFFEN BEVATTEN DE GENETISCHE INFORMATIE?
EXPERIMENTEEL ONDERZOEK
Waarnemingen  waarschijnlijk de chromosomen zijn die de dragers zijn van de genetische info
Chromosomen
 Draadvormige structuren
 Bestaan uit DNA en die drager zijn van de genen
 Tijdens celdeling zichtbaar
 Worden verdeeld over de twee dochtercellen

 Wat ze juist zijn, en uit welke stoffen ze bestaan wat toen nog totaal onbekend

Om dit te onderzoken moest men de componenten van de weefsles of cellen gaan scheiden (cel
fractioneren)

1) Homogeniseren van cellen: detergent (zullen membranen gedeeltelijk oplossen) of mechanisch
breken (mixer of ultrasoon geluid)  cellen worden dus stuk gemaakt, zo komen de verschillende
componenten van de cel in de oplossing komen
2) Filtreren van homogenaat om de grote brokstukken te verwijderen
3) Oplossing verdelen in fracties met behulp van ofwel een defferentiële centrifugatie ofwel een
densiteitsconfiguratie
a. Differentiële ultracentrifugatie
- Homogenaat wordt lage rotatie-snelheid gecentrifugeerd, middelpuntvliedende kracht
wordt groter dan de zwaartekrach
- Zwaarste celorganellen bevinden zich als eerste op de bodem  vormen “pellet”
- Resterende vormt het “supernatans”
- De naam slaat op het hoge toerental = hoge g-krachten
- Kan opnieuw gescheiden worden door een hoger toerental (bij elke stap steeds kleinere
organellen naar de bodem)  voor de scheiding van cytoplasme heb je een toerental van
50.000 rpm nodig

b. Densiteitscentrifugatie
- Verchillende lagen met stijgende sucrose-concentratie in centrifugebuis (er zal geen
homogeen mengsel ontstaan door densiteitsverschillen, onderaan is de hoogste
concentratie)



3

, - Boven komt celhomogenaat  wordt gecentrifugeerd  migreren richting bodem totdat ze
op de laag van hun densiteit zijn
aangekomen  opwaartse druk =
neerwaartse  levert scheiding op

De scheiding kan ook verkregen worden door
homogene oplossingen van CsCl (cesiumchloride) bij
hoge rotatiesnelheden te centrifugeren, omdat het
CsCl naar de bodem zal zakken en er een
concentratiegradiënt ontstaat  vaak gebruikt om
isotopen te scheiden: men kan dus bv. DNA met
koolstof-12 scheiden van DNA met koolstof-14.


HET EXPERIMENT VAN GRIFFITH
Gebruik gemaakt van S-stam (glad) en R-stam (onregelmatig) van bacterie streptococcus pneumoniae, deze
veroorzaakt een longontsteking

De volgende homogenaten werden ingespoten bij muis:
 De S-stam injecteren → longontsteking
 De R-stam injecteren → geen longontsteking
 Verhitte S-stam injecteren → geen longontsteking
 Een gehomogeniseerde S-stam + de R-stam → longontsteking: de R-stam nam het dodelijke deel van
de S-stam over

Bacteriën konden genen uit de omgeving opnemen (= transformatie)  welke stof verantwoordelijk?
 S-homogenaat te scheiden in RNA, eiwitten, DNA, vetten en koolwaterstoffen
 Bij alle 5 groepen -> R-stam toegevoegd, deze ingespoten bij de muis
 Enkel muizen met DNA (afkomstig van S-homogenaat) ontwikkelden longontsteking
 Groep kan R-stam transformeren naar S-vrom

 Eerste keer aangetoond dat DNA de erfelijke info (of genen) bevat


HET EXPERIMENT VAN HERSHEY-CHASE
Worden de eigenschappen overgebracht door eiwitten of door DNA van de bacteriofagen?
Bacteriofagen= virussen van bacteriën  parasiteren en na infectie komen genen tot expressie waardoor
bacteriofaag-DNA wordt aangemaakt  barst open en ontsaan nieuwe bacteriofagen

Twee culturen E. Coli die beiden werden besmet met bacteriofagen.
 E. coli + fagen + zwavel-35 (kan enkel inbouwen in eiwitten): na schudden en centrifugeren van fagen
met radioactief zwavel-35  radioactief zwavel in de eiwitten ingebouwd en dus in het pellet zaten
 E. coli + fagen + fosfor-32 (kan enkel inbouwen in DNA): na schudden en centrifugeren van
bacteriofagen met radioactief DNA fosfor-32 in het pellet zat en dus ingebouwd waren in het DNA

 Na centrifugatie kwamen bacteriën in pellet terecht en bacteriofagen in supernatans. Men zag dat het
pellet radioactief was door het fosfor (dus ook de bacteriën) terwijl het radioactief zwavel in het supernatans
achterbleef
 Het DNA (radioactief fosfaat) bevat de erfelijke informatie over de bouwstenen (zowel DNA als eiwitten)
van de bacteriofagen


DEOXYRIBONUCLEÏNEZUUR
Examenvraag: Bespreek DNA
DNA of deoxyribonucleïnezuur bestaat uit lange polymeren (1m DNA per menselijke cel) die zijn opgebouwd
uit:

4

, Deoxyribose (suiker) of beta-D-2-ribose, een pentose afgeleid van beta-D-ribose: aan elkaar
verbonden via fosfodiesterverbindingen: 5’-C via een fosfaatgroep met 3’-C van vorige
 Fosfaatgroepen: ribose en fosfaat wisselen elkaar af in de ruggengraat, de fosfaatgroepen zijn
gekoppeld aan het 5’ uiteinde van het deoxyribose
 De 4 verschillende nucleobasen: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T)
 Purines: adenine en guanine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in cel
voor
 Pyrimidines: thymine en cytosine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in
cel voor
 Nucleoside = base verbonden aan deoxyribose via N-glycosidische binding: adenosine, cytidine,
thymidine, guanosine, uridine. De nucleosiden zijn beter oplosbaar in water in vergelijking met de basen
 Nucleotide = fosfaatgroep verbonden aan 5’-C van nucleoside. Deze komt meestal vrij voor in de cel.
De synthese van nucleotiden is mogelijk via 3 manieren: ofwel gewoon opbouwen, ofwel partiële
hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen ofwel door afbraak van vrijgekomen basen, ze kunnen door
enzymatisch recuperatieproces omgezet worden tot nucleotiden.




Aan het 5’ C-atoom van de suiker kunnen maximaal 3 fosfaatgroepen worden gehangen via fosfo-
anhydridebindingen tot vorming van nucleotide-tri-fosfaten (NTPs). Hierin worden fosfaatgroepen
achtereenvolgens aangeduid met α, β en γ, startend vanaf suikerring. β en γ fosfaatgroepen kunnen worden
afgesplitst door enzymen zonder andere bindingen te verbreken. NTPs zijn belangrijkste overdragers van
biochemische energie. Voorbeeld: ATP-ADP, ook andere kunnen ‘fosfaatenergie’ leveren aan
biosynthetische reacties




ANDERE BELANGRIJKE BASEN EN NUCLEOTIDEN
 cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat):
 Signaalmolecule, gesynthetiseerd door adenylaatcyclase (α-fosfaat ATP wordt verbonden met 3’OH
ribose)
 Concentratie aan cAMP wordt bepaald door de enzymen die het aanmaken en de enzymen die het
afbreken
5

,  Afgebroken door het enzyme fosfodiësterase AMP (door hydrolyse van verbinding tussen fosfaat en
3’OH ribose)
 Co-enzym A:
 Betrokken bij acyltransferreacties
 NAD (nicotinamide adenine dinucleotide):
 Betrokken met elektrontransferreacties
 FAD (flavin adenine dinucleotide):
 Betrokken met elektrontransferreacties
 SAM (S-adenosylmethionine):
 Methyldonor in verschillende methyleringen van basen en eiwitten
 Caffeïne:
 Inhibitor fosfodiësterase (omzetting van cAMP naar AMP)  stijgt c aan cAMP  houdt organisme
in geëxciteerde toestand
 AZT (3’-azido-2’-deoxythymidine):
 AIDS remmer, inhibeert het enzyme reverse-transcriptase van HIV-virus waardoor er minder nieuwe
virussen worden gevormd (verhindert DNA synthese/replicatie, niet van de menselijke cellen)
 Tenofovir inhibeert HIV op gelijkaardige wijze  miljoenen menselevens gered




EIGENSCHAPPEN VAN DNA
HET MODEL VAN DE BETA-HELIX
Regels van Chargaff
 Voor hetzelfde organisme relatieve hoeveelheden van de basen
gelijk zijn voor verschillende soorten
 #A = #T en #G = #C
6

,Rosalind Franklin
 Bepaling van structuur van DNA door X-straaldiffracties op gekristalliseerd DNA te bestuderen
 Werd duidelijk dat de algemene structuur helicaal is

Watson en Crick: opstellen van dubbele-helix-hypothese
 Dubbelstrengig en antiparallel
 De 5’ naar 3’ richtingen zijn parallel maar wijzen in de tegenovergestelde richting
 Baseparing: associatie van pyrimidine met purine: A met T en C met G
 De lengte van de waterstofbruggen zijn overal gelijk
 De basen naar elkaar gekeerd liggen en de negatief geladen fosfaatgroepen aan de buitenkant en
naar het water toe gekeerd zijn.
 De negatieve ladingen in fysiologische omstandigheden geneutraliseerd (meestal door Na+)
 Complementair genoemd omdat ze waterstofbruggen kunnen vormen
 Liggen in een vlak dat ongeveer loodrecht staat op de ruggengraat.
 DNA is zeer stabiel:
 Waterstofbruggen (2 tussen A en T, 3 tussen C en G)  zelf niet stabiel
maar de # maakt het wel stabiel
 Strengen kunnen uit elkaar gehaald worden door H-bruggen te
verbreken door een hoge T (A-T gaan sneller uit elkaar)
 Van der Waalskrachten tussen opeenvolgende basen  idem H-bruggen
over stabiliteit
 Specifieke basenstapeling (polaire oppervlakten naar buiten gekeerd,
zodat negatieve afstoting onderling wordt voorkomen)
 De dubbele helix heeft 10,4 basenparen per winding van 360°
 DNA kan verschillende helices vormen:

 B-vorm: meest frequente vorm:
 Backbone (ribose + fosfaatgroepen) is naar buiten gekeerd en basenparen naar binnen
 Deze vorm heeft een grote en kleine groeve  N-glycosidische bindingen niet precies
diametraal tegenover elkaar liggen
 De O-2 van de pyrimidine en de N-3 van de purine zijn steeds naar de kleine groeve gekeerd
 Z-DNA: een andere helix-vorm
 Tripel-helix: hierin zitten 3 strengen verwikkeld

HOE WORDT EEN BASENVOLGORDE IN DNA GENOTEERD?
We hebben altijd maar één sequentie nodig, omdat de andere complementair anti-parallel verloopt
 Sense streng 5’ → 3’: indien er een streng gegeven wordt, is het meestal deze (5’ links)
 Anti-sense streng 3’ → 5’: hiervan wordt mRNA afgelezen




WAT IS EEN PALINDROMISCHE SEQUENTIE?
 Palindroomsequenties = sequenties waarvan beide helices in gelijke richting dezelfde sequentie
hebben  De onderste streng moet worden omgedraaid (vb. 5’-TCCGATCGGA-3’ → 3’-
AGGCTAGCCT-5’)  TCCGAAGCCT IS ER GEEN
 Deze kunnen herkend worden door restrictie-enzymen = endonucleasen die DNA-ruggengraat
specifiek kunnen knippen ter hoogte van deze sequentiemotieven  grote DNA-fragmenten
(chromosonen) kunnen worden verdeeld in kleinere fragmenten mbv deze enzymen


7

,HYPERCHROMICITEIT EN HYBRIDISATIE
DNA absorbeert UV licht (260 nm) owv de gejonjugeerde bindingen in de bases. Een zuivere oplossing van
50 micro g/ml zal deze rode curve vertonen:

Op 260 nm  max
Op 180 nm  de helft
 Als het zuiver DNA is is de verhouding
tussen de absorptie op 260 en 180 = 2
 Als er eiwitten bijzitten dan >2




Dubbelstrenging DNA neemt minder licht op dan enkelstrengig  er
bestaat een maximale waarde, namelijk de smelt T van DNA (85°C)

Denaturatie
 Door een verhoging van de T
 DNA wordt enkelstrengig
 Op dit punt  Hyperchromiciteit
 Hier neemt lichtabsorbtie ineens snel toe
Hybridiseren
 Als T terug afkoelt
 2 strengen vinden elkaar terug omw compementariteit
 DNA wordt terug dubbelstrengig
 Voorwaarde: DNA mengsel niet te complex is en de temperatuurdaling traag gebeurt


DNA-ELEKTROFORESE
Examenvraag: Bespreek DNA-elektroforese: geef een schema en leg de verschillende stappen uit.

Hiermee kun je:
 DNA bekijken
 DNA met verschillende lengten schijden
 DNA-fragmenten zuiveren

Hoe werkt het?
 Agarose-gel
 Zeewierextract, een niet-ionisch, sterk hydrofiel en gellerend
polysacharide, pas gel-vormend na afkoeling)
 Aangebracht in een bak met een elektrisch veld
 Fosfaatgroepen zijn negatief  DNA naar positief bewegen
 Zonder gel zullen de verschillende lengtes even snel bewegen
 Scheiding
 Vindt plaats omdat het lange DNA moeilijker doorheen de netwerken van de gel kunnen wringen
 Zichtbaar maken
 Vroeger: EthidiumBromide (EtBr)
 Zet zich tussen de basenparen in deubbelstrengig DNA (vlakke/planaire stof)
 Fluorisceert onder UV-licht, hierdoor weet men waar zich het DNA bevindt
 Nu: SYBR-Safe
 Want EtBr is kankerverwekkend
 Door een vergelijking te maken met DNA-fragmenten van gekende lengte, kan men de lengte van een
DNA fragment extrapoleren



8

,HFD 2: DNA-REPLICATIE
INLEIDING
 DNA kan zeer lang zijn  sterk opgerold
 Kopiëren  snel en correct
 DNA ontwonden en weer opgerold tot het expressie komen v kenmerken
 Voortplanting  kenmerken en hun info doorgegeven
Diploïde cel mens: 6,6 x 10^9 bp
 Menselijke cellen  kunnen om de 8u delen
E-coli: 4,5 x 10^6 bp
 Juiste kopie van DNA doorgeven aan dochtercellen
Lichaam mens:5 x 10^13 cellen
 Gevolg v 1 foutje op 1 miljoen basis is niet min
 Bevruchte eicel 6,6 miljard basenparen heeft en deze 10^16 keer zal delen  2 lichtjaar DNA synthese


REPLICATIE IS SEMI-CONSERVATIEF
Mogelijke theoriën:
 Conservatief (volledig behouden)
 Vorming van 2 nieuwe complementaie strengen
 Dispersief (stukjes van beide)
 Semi-conservatief (half-behoudend)
 1 nieuwe complementaire streng
 Één streng van de moder
 Al besproken door Watson en Crick bij hun DNA
helix model

Welke is nu juist?
 Densiteitscentrifugatie in combinatie met isotoop van stikstof 15N, deze heeft hogere densiteit dan 14N
 Bacteriën ontwikkeld met enkel 15N  ingebouwd in
dochterbacteriën
 Met behulp van CSCL scheiden v zwaar en licht DNA
 Bacteriën terug in normaal medium
 Na 1 deling (20 min)  DNA lichter, maar nog niet op normale niveau
 2 delingen  2 niveaus aanwezig
 Volledig 14N
 Niveau nog daartussen
 Deze was het bewijs voor welke replicatie DNA heeft
 Enkele generaties verder  terug 14N

 Conservatief is fout: 4de op verkeerde hoogte
 Dispersief is fout: anders maar 1 band te zien
 Semi-conservatief is dus juist



DNA-POLYMERASE
Staat in voor DNA-synthese (enzyme)
 Op basis van deoxyribonucluotides DNA maken, door deoxy-ribonucleoside-monofosfaten (dNMPs)
te activeren
 Activatie  5’ positie twee bijkomende fosfaatgroepen worden aangebracht door kinasen
 Hierdoor ontstaan deoxy-ribonucleoside-trifosfaten (dNTPs )




9

,  DNA-polymerasen  vrije 3’-OH-uiteinde nodig om te kunnen polymiseren
 Kunnen zelf dus niet starten
 Door het DNA pol een complementaire base geselcteerd (t.o.v. de bestaande streng)
 Pyrofosfaat wordt verwijderd en gehydrolyseerd tot anorganisch fosfoot (Pi)
 Hierdoor is de polymerisatie onomkeerbaar
 Verklaart waarom polymerisatie van 5’ naar 3’ opgaat
 5’ uiteinde van dNTP gaat verbonden worden met de 3’ OH groep van de DNA keten
 (Het 5’-uiteinde van een nieuw nucleotide gekoppeld wordt aan de 3’-OH-groep van de groeiende
DNA-keten)


DE REPLICATIEVORK
Replicatie start ter hoogte van ORI (origin of replication)
 DNA gaat uit elkaar
 Synthese van nieuwe strengen naar links en rechts
 Men spreekt van twee replicatievorken

De vorm waarin DNA voorkomt wanneer het wordt gesynthetiseerd
 Deels gehybridiseerd
 Deels gedenatureerd

Enzymes nodig ter hoogte van de replicatievork: let op (DNA =/= Dna)
Helicase  Gevormd als ring van 6 moleculen (Dna B bij prokaryoten)
 Strengen uit elkaar halen  1 vd 2 passeert door de ring  breken H-bruggen
 Energie uit ATP hydrolyse
Topo-isomerase  Ontstaat superwinding door uit elkaar halen DNA
 Verwijderd door 2 enzymes
 Topisomerase I
 Relaxeert door 1 streng open te knippen  hierdoor kan andere DNA vrij
rondraaien
 Breuk terug gesloten
 Energie van superwinding zelf, niet ATP
 Campothecin
 Inhibeert  DNA in de knoop komt en helicase niet meer verder kan
werken
 Tumor agens
 Nu moleculen gebruitk met minder tegenwerkingen
 Topisomerase II (prokaryoten: DNA gyrase)
 Kan superwinding introduceren
 Beide strengen worden gebroken
 Een tweede helix door de opening gehaald
 Hersteld
 Wel ATP
 Ciprofloxacin inhibeert bacterieel topo II
 Door ATP inhibitie,
 Toegepast bij infecties bv urinewegen
Single stranted  DNA kan enkelstrengig makkelijk aangevallen worden  SSBP-enzymes
binding proteins beschermen
 Voorkomen hybridisatie DNA na denaturatie
Primase  RNA-polymerase enzyme
 Maakt korte RNA-fragmenten (primer), complementair aan enkelstrengig DNA
 Noodzakelijk voor creëeren 3’OH-uiteinde  herkent door DNA-polymerase als
startpositie voor synthese
DNA-polymerase 𝛿  DNA synthese in 5’→ 3’ richting door DNA-polymerase 𝛿 (delta)
(prokaryoten: III)  Mitochondriaal DNA wordt gerepliceerd door DNA-polymerase γ (gamma)
Sliding clamp  Schuift over DNA als een klem
10