Biochemie – Complete Samenvatting

BIOCHEMIE
WEEK 1: EIWITTEN EN EIWITISOLATIE

Eiwitfuncties:
- Enzymen (katalyseren)
- Antilichamen
- Opslag (bijv albumine)
- Transport (hemoglobine)
- Hormonen (insuline/glucagon)
- Receptor (neurotransmitters)
- Contractile en montor proteins (spier)
- Structuur (collageen)
Eiwitten zijn lineaire peptiden opgebouwd uit 20 aminozuren
- Aminozuur is een organisch molecuul met een carboxyl en een
aminogroep
- Aminozuren verschillen in eigenschappen door de zijketens (R-
groep)
Eiwitten zijn polypeptides
- Peptide = kort aminozuur polymeer
- Dipeptide = 2 aminozuren
- Tripeptide = 3 aminozuren
- Oligopeptide = 12-20 aminozuren
- Polypeptide = veel aminozuren (meer dan 20)
Hydrofobische aminozuren:
- Glycine/glu/g
- Alanine/ala/a
- Valine/val/v
- Isoleucine/ile/I
- Leucine /leu/ L
- Methionine/met/m
- Phenulalanine/phe/F
- Tryptophan /trp/w
- Prolyne /pro/O
Hydrofiele aminozuren
- Serine/ser/s
- Threonine/thr/t
- Cysteïne/cys/c
- Thyrosine/tyr/y
Hydrofiele eiwitten/polaire R-groepen

, - Asparagine/asn/n
- Glutamine/glu/q
Hydrofiele eiwitten / zure (negatief geladen) R-groepen
- Lysine/lys/k
- Argininine/arg/r
- Histidine/his/h
Aminozuren zijn essentieel als het lichaam ze niet kan maken en als ze
dus uit voeding gehaald moeten worden
Aminozuren als zwitterion
- Een zwitterion is een verbinding met zowel een positieve lading als
een negatievee lading op hetzelfde molecuul
o Aminozuren zijn ionische verbindingen
o In oplossing ladingopbouw afhankelijk van de pH
 Boven een pH van 4,5 gaat de H+ van carboxyl-groep
weg, er ontstaat dan een netto lading van 0
 Bij een verhoogde pH (hoger dan 10) gaat de H+ van de
amino-groep weg, er ontstaat dan een netto lading van -
1
 Hoe basischer de oplossing hoe negatiever het
aminozuur
 Hoe zuurder de oplossing hoe positiever het
aminozuur
o Bij het isoelektrischpunt (IEP/IP) is de nettolading van het
aminozuur 0
o pKa > pH = gedeprotoneerd (-)
o pKa < pH = geprotneerd (+)
Aminozuren zijn verbonden met peptide-bindingen
- N-terminaal is aan de voorkant van het eiwit (aan de
aminogroep kant)
- C-terminaal is aan de achterkant van het eiwit (aan
de carboxylgroep kant)
Een peptide binding is ‘vlak’ door de chemische resonantie (mesometrie)
- Mesometrie is het verspringen van de dubbele binding (net zoals in
een benzeen ring)
De volgorde van aminozuren bepaalt de 3D structuur van een eiwit en de
ruimtelijke structuur bepaald de functie

EIWIT STRUCTUUR

Primaire structuur, de aminozuur volgorde. Stel je hebt een eiwit van 60
aminozuren, dan heb je een mogelijkheid van 2060 aminozuren

,Secundaire structuur, de α helix, β pleated sheets en random coils. Deze
structuren zijn het gevolg van waterstofbruggen tussen de herhalende
eenheden van de polypeptide backbone.
- De α helix is een spiraal die met de klok mee draait, deze helix
structuur ontstaat door de H-bruggen tussen de carboxyl en
amniogroep 4 aminozuren verder op.
- β pleated sheets zijn plaatvormige ruimtelijke structuren die bestaat
uit individuele β-strands, deze strands kunnen intra- en interchain
zijn, dit komt door de reactie met de backbone
- Random coils, eigenlijk hebben alle eiwitten random coils. Dit komt
doordat een eiwit niet alleen uit α helix en β pleated sheets kan
bestaan. Random coils ontstaan door niet repeterende secties.
Tertiaire structuur is de overall 3D
structuur van een eiwit. Dit ontstaat door
de waterstof- en zwavelbruggen, ion
bindingen en covalente bindingen.
Hierdoor omvat het de peptidebinding
maar ook de zij-ketens maar ook
metaalionen en co-factoren. De 3D
structuur bepaalt de functie en reactiviteit van een eiwit.
- De covalente bindingen zijn de peptide bindingen en de S-bruggen.
Waterstofbruggen ontstaan tussen de backbone en de zijketens, en
electrostatische interacties ontstaan door de zoutbruggen/ metaal
ion hydrofobe interacties
De quaternaire structuur ontstaat als er twee of meer polypeptide ketens
1 complex macromolecuul vormen.

VERANDERING IN OMSTANDIGHEDEN
Behalve bij de primaire structuur hebben ook fysische en chemische
condities invloed op de structuur. Veranderingen in o.a. pH, zout
concentratie en temperatuur kunnen een eiwit denatureren. Denaturatie is
het verlies van de ruimtelijke structuur. Een gedenatureerd eiwit is een
biologisch inactief eiwit.
- Hitte kan denatureren
- 6 M urea -> H-bruggen worden verbroken
- Detergentia -> verbreking non-covalente bindingen
- Reducerende verbindingen -> S-S bindingen
- Zuren/ basen/zouten -> zoutbruggen
- Zware metaal ionen
Alleen RNase kan renatureren

, EIWIT STRUCTUUR VOORSPELLEN
Een eiwit structuur is te voorspellen vanuit de primaire structuur, dit is
echter erg moeilijk. Voor meer accurate voorspellingen worden
bioinformatica, X-ray crystallography en Nuclaer magnetic resonance
(NMR) spectroscopy gebruikt.
Caperonine helpt bij vouwing van een eiwit.

PROTEIN ISOLATIE EN ZUIVERING

Weet je iets van het eiwit?
- Functie
- Locatie
- Optimum temperatuur, pH, etc.
Wat wil je?
- Zuiverheid
- Hoeveelheid
Strategie
1. Eiwit uit de cel krijgen in oplossing
2. Eiwit intact houden (temperatuur)
3. Eerste zuiveringsstappen; laagste resolutie/hoogste capaciteit -> zo
raak je zoveel mogelijk rest eiwit kwijt
4. Meerdere methoden gebaseerd op verschillende eigenschappen in
plaats van serie gebasseed op dezelfde eigenschap
5. Optimaliseer zuiverheid / opbrengst
6. Monitor purificatie
a. Opbrengst
b. Activiteit (d.m.v. assay)
c. Specifieke activiteit/ verrijking/ opbrengst)


Voorbehandeling
- Wassen (verwijderen van verontreinigingen)
o Veel gebruikte buffers
 PBS (phosphate buffer saline, sodum chloride, 145mM
0,85% in phosphate buffer, 150mM pH 7,2)
 Tris buffer sucrose (10mM tris, 250 mM sucrose ph 7,2)
 Osmoticum om cellysis te voorkomen
Cel disruptie
- Heftig (vigorous) lysis methode (mechanisch)
o Sonificatie probe (cell suspension), gebruik van ultrasound
energie