Samenvatting Moleculaire Technieken
Les 1:
Kloneren wordt gedaan om meerdere kopies te maken van een enkel gen
Het IDH1 gen zal in een plasmide geplaatst
worden door middel van restrictie enzym
analyse. Maar eerst zal het IDH1 gen moeten
worden geamplificeerd met behulp van
restrictie sites, amplificeren zal worden
gedaan met behulp van een PCR. Als de
restrictie sites aan je gen zitten kun je deze
knippen, vervolgens heb je get gen dat precies
in de plasmide geplakt kan worden en
vervolgens in een bacterie gezet kan worden
zodat deze het kan vermeerderen
Wat zit er allemaal in een PCR master mix?
- DNA template = hier zit het gen in
- DNA polymerase = enzym dat je nodig hebt om de nucleotide in de nieuwe streng te bouwen
- Forward en Reverse primers = dienen als startpunt voor DNA polymerase door middel van
een vrije 3’OH
- Reactie buffer = om het pH niveau stabiel te houden voor DNA polymerase zodat deze
optimaal kan werken
- MgCl2 = is een co-factor voor DNA-polymerase om zijn werk te doen
- dNTP’s = bouwstenen (losse nucleotides) voor de nieuw gevormde streng
DNA template kan zowel plasmide DNA, genomisch DNA uit de cel of cDNA (reverse-transcriptase
van mRNA waarbij het alleen bestaat uit exonen, het coderende gedeelte) zijn. De concentratie DNA
mag niet te weinig maar ook niet teveel zijn. Teveel DNA zal de PCR reactie verstoren.
Soorten DNA polymerase;
- Vaak gebruikt, Taq DNA polymerase. Thermus aquaticus (bacterie die leeft in warmte), is erg
nauwkeuring maar heeft geen proofreading.
- Pfu DNA polymerase. Pyrococcus furiosus (Aquatisch anaëroob hyperthermofiel), heeft
proofreading die 10x lagere foutmarge heeft dan Taq
- Phusion High-Fidelity DNA polymerase. Heeft een 50x lagere foutmarge dan Taq, en een 6x
lagere foutmarge dan Pfu
Stappen om primers te ontwerpen
- Forward en reverse primers wijzen naar elkaar met 3' uiteinden
- Reverse primers moet je complementair schrijven, dus omdraaien (van 5’ naar 3’)
- 19 - 24 nucleotiden lang voor een hoge specificiteit
- CG-gehalte ± 50 - 60%
- 3'-uiteinde moet C of G bevatten, dit is stabieler
- Geen interne complementaire sequenties, anders gaan de primers aan
elkaar hecten (haarspeldvorming)
- Niet complementair aan zichzelf of aan elkaar (primer dimer formatie)
- Afstand tussen de primers ≤ 1-2 kb (voor gewone PCR-reactie)
- annealingtemperatuur ± 55 tot 65°C
- Verschil in annealingtemperatuur tussen primers ≤ 5 °C
, PCR programma bestaat uit 3 stappen;
- Denaturatie vindt plaatst rond de 95-98 graden, dit wordt gedaan om het dubbelstrengs DNA
uit elkaar te halen met behulp van hitte, maar het mag niet te heet omdat DNA polymerase
een eiwit is die uit zichzelf kan denatureren. Tijdens deze stap zullen ook de primers hechten
- Annealing vindt meestal plaats tussen de 50-60 graden, afhankelijk van de primerset. Dit
wordt gedaan om een startpunt te bieden aan DNA polymerase zodat deze het DNA kan
amplificeren. Is de temperatuur te laag, dan kunnen de primers niet op de juiste plek binden
omdat moleculen niet zo hard bewegen, hierdoor kunnen aspecifieke bindingen worden
gevormd. Als de temperatuur te hoog is bewegen de moleculen te hard waardoor de primers
kunnen loslaten en er dus geen product ontstaat. In de eerste cycli kan alleen het deel dat
complementair is aan het oorspronkelijke template annealen!
- Elongatie/extensie vindt plaats op 72 graden, hierbij wordt het DNA verlengd door DNA
polymerase. Is de temperatuur te hoog dan kan DNA polymerase niet goed binden en zal
deze loslaten.
- De boven genoemde stappen worden een aantal cycli herhaald en vervolgens op hold (4
graden) gezet.
Het berekenen van de annealing en elongatie tijd
- Annealing = bereken de smelt temperatuur van beide primers, CG telt als 4 graden en AT telt
als 2 graden, het verschil tussen beide primer moet ≤5 graden zijn. Gebruik vervolgens de
laagste temperatuur en trek daar 2-5 graden vanaf, maar houd het verschil ≤5 graden tussen
beide primers.
- Elongatie = bepaal de totale lengte van het PCR product, van 5’ forward primer tot 5’ reverse
primer. Taq DNA polymerase heeft 60 seconde nodig per 1000 nucleotiden
Les 1:
Kloneren wordt gedaan om meerdere kopies te maken van een enkel gen
Het IDH1 gen zal in een plasmide geplaatst
worden door middel van restrictie enzym
analyse. Maar eerst zal het IDH1 gen moeten
worden geamplificeerd met behulp van
restrictie sites, amplificeren zal worden
gedaan met behulp van een PCR. Als de
restrictie sites aan je gen zitten kun je deze
knippen, vervolgens heb je get gen dat precies
in de plasmide geplakt kan worden en
vervolgens in een bacterie gezet kan worden
zodat deze het kan vermeerderen
Wat zit er allemaal in een PCR master mix?
- DNA template = hier zit het gen in
- DNA polymerase = enzym dat je nodig hebt om de nucleotide in de nieuwe streng te bouwen
- Forward en Reverse primers = dienen als startpunt voor DNA polymerase door middel van
een vrije 3’OH
- Reactie buffer = om het pH niveau stabiel te houden voor DNA polymerase zodat deze
optimaal kan werken
- MgCl2 = is een co-factor voor DNA-polymerase om zijn werk te doen
- dNTP’s = bouwstenen (losse nucleotides) voor de nieuw gevormde streng
DNA template kan zowel plasmide DNA, genomisch DNA uit de cel of cDNA (reverse-transcriptase
van mRNA waarbij het alleen bestaat uit exonen, het coderende gedeelte) zijn. De concentratie DNA
mag niet te weinig maar ook niet teveel zijn. Teveel DNA zal de PCR reactie verstoren.
Soorten DNA polymerase;
- Vaak gebruikt, Taq DNA polymerase. Thermus aquaticus (bacterie die leeft in warmte), is erg
nauwkeuring maar heeft geen proofreading.
- Pfu DNA polymerase. Pyrococcus furiosus (Aquatisch anaëroob hyperthermofiel), heeft
proofreading die 10x lagere foutmarge heeft dan Taq
- Phusion High-Fidelity DNA polymerase. Heeft een 50x lagere foutmarge dan Taq, en een 6x
lagere foutmarge dan Pfu
Stappen om primers te ontwerpen
- Forward en reverse primers wijzen naar elkaar met 3' uiteinden
- Reverse primers moet je complementair schrijven, dus omdraaien (van 5’ naar 3’)
- 19 - 24 nucleotiden lang voor een hoge specificiteit
- CG-gehalte ± 50 - 60%
- 3'-uiteinde moet C of G bevatten, dit is stabieler
- Geen interne complementaire sequenties, anders gaan de primers aan
elkaar hecten (haarspeldvorming)
- Niet complementair aan zichzelf of aan elkaar (primer dimer formatie)
- Afstand tussen de primers ≤ 1-2 kb (voor gewone PCR-reactie)
- annealingtemperatuur ± 55 tot 65°C
- Verschil in annealingtemperatuur tussen primers ≤ 5 °C
, PCR programma bestaat uit 3 stappen;
- Denaturatie vindt plaatst rond de 95-98 graden, dit wordt gedaan om het dubbelstrengs DNA
uit elkaar te halen met behulp van hitte, maar het mag niet te heet omdat DNA polymerase
een eiwit is die uit zichzelf kan denatureren. Tijdens deze stap zullen ook de primers hechten
- Annealing vindt meestal plaats tussen de 50-60 graden, afhankelijk van de primerset. Dit
wordt gedaan om een startpunt te bieden aan DNA polymerase zodat deze het DNA kan
amplificeren. Is de temperatuur te laag, dan kunnen de primers niet op de juiste plek binden
omdat moleculen niet zo hard bewegen, hierdoor kunnen aspecifieke bindingen worden
gevormd. Als de temperatuur te hoog is bewegen de moleculen te hard waardoor de primers
kunnen loslaten en er dus geen product ontstaat. In de eerste cycli kan alleen het deel dat
complementair is aan het oorspronkelijke template annealen!
- Elongatie/extensie vindt plaats op 72 graden, hierbij wordt het DNA verlengd door DNA
polymerase. Is de temperatuur te hoog dan kan DNA polymerase niet goed binden en zal
deze loslaten.
- De boven genoemde stappen worden een aantal cycli herhaald en vervolgens op hold (4
graden) gezet.
Het berekenen van de annealing en elongatie tijd
- Annealing = bereken de smelt temperatuur van beide primers, CG telt als 4 graden en AT telt
als 2 graden, het verschil tussen beide primer moet ≤5 graden zijn. Gebruik vervolgens de
laagste temperatuur en trek daar 2-5 graden vanaf, maar houd het verschil ≤5 graden tussen
beide primers.
- Elongatie = bepaal de totale lengte van het PCR product, van 5’ forward primer tot 5’ reverse
primer. Taq DNA polymerase heeft 60 seconde nodig per 1000 nucleotiden
