Molecular biology of the cell
Hoofdstuk 5
Mutation = permanente verandering in DNA
Mutation rate = de snelheid waarmee veranderingen in DNA sequenties voorkomen
-Bacteriën hebben een mutation rate van 3 nucleotide veranderingen per 10 10 nucleotiden
per cel generatie.
-De mutation rate voor de mens is 1 nucleotide verandering per 10 8 nucleotiden per
generatie. En per celdeling 1 mutatie/1010 nucleotiden
2 soorten cellen van seksueel voortplantend dier of:
Geslachtscellen: dragen genetische informatie
over van ouder naar nageslacht
somatische cellen: vormen het lichaam van het
organisme
DNA polymerase voegt deoxyribonucleotide toe aan 3’ eind van nieuwe streng. De reactie
wordt aangedreven door een grote, gunstige verandering in vrije energie, veroorzaakt door
het vrijkomen van pyrofosfaat en de daaropvolgende hydrolyse tot twee moleculen
anorganisch fosfaat.
Replicatie gebeurd in replication fork. Hier synthetiseert een complex met DNA polymerase
de nieuwe dochterstrengen.
DNA polymerase maakt leading strand van 5’->3’ en lagging strand met okazaki fragmenten.
Heeft proofreading
De juiste nucleotide heeft een hogere affiniteit voor het bewegende
polymerase dan het verkeerde nucleotide, omdat de juiste paring
energetisch gunstiger is.
Exonucleolytic proofreading vindt plaats gelijk na de covalente binding van
verkeerde nucleotide. Met 3’->5’ proofreading exonuclease
RNA polymerase heeft geen primer nodig. Errors gaan niet naar volgende
generatie.
,DNA primase maakt korte RNA primers op de lagging strand. In
eukaryoten ongeveer 10 nucleotiden lang om de 100-200 nucleotiden.
Waarom RNA primer en geen DNA primer: de ribonucleotiden in de
primer markeren deze sequenties automatisch als "verdachte kopie" om
efficiënt te worden verwijderd en vervangen.
DNA helicase kan beide kanten op.
Single-strand DNA-binding (SSB) proteins, ook wel helix-destabiliserende
eiwitten genoemd, binden stevig en coöperatief aan blootgesteld
enkelstrengs DNA zonder de basen te bedekken, die daarom beschikbaar
blijven als sjablonen. Deze eiwitten zijn niet in staat om direct een lange
DNA-helix te openen, maar ze helpen helicases door de
afgewikkelde enkelstrengs conformatie te stabiliseren.
Bovendien bedekken ze, door middel van coöperatieve
binding, de gebieden van enkelstrengs DNA, die routinematig
voorkomen in de achterblijvende streng-matrijs, en maken ze
recht, waardoor de vorming van de korte haarspeldhelices
wordt voorkomen die zich gemakkelijk vormen in enkelstrengs
DNA. Als ze niet worden verwijderd, kunnen deze
haarspeldhelices de door DNA-polymerase gekatalyseerde
DNA-synthese belemmeren.
De sliding clamp houdt het polymerase stevig op het DNA wanneer het beweegt, maar laat
het los zodra het polymerase in een dubbelstrengs DNA-gebied loopt.
De assemblage van de klem rond het DNA vereist ATP-hydrolyse door een speciaal
eiwitcomplex, de clamp loader die ATP hydrolyseert terwijl het de klem op een primer-
sjabloon-junctie laadt.
De DNA-polymerase op de lagging-strand-template maakt ook gebruik van de klem, maar
elke keer dat de polymerase het 5'-uiteinde van het voorgaande Okazaki-fragment bereikt,
laat de polymerase zichzelf los van de klem en dissocieert het van de template. Dit
polymerasemolecuul associeert vervolgens met een nieuwe klem die wordt geassembleerd
op de RNA-primer van het volgende Okazaki-fragment.
,DNA polymerase op beide strengen.
Strand-directed mismatch repair
verwijdert fouten die de
proofreading exonuclease heeft
gemist en detecteert het potentieel
voor vervorming in de DNA-helix
van de misfit tussen niet-
complementaire basenparen.
In E.coli methylatie van A’s.
Eukaryoot: Nieuw gesynthetiseerd lagging-strand DNA bevat tijdelijk nicks (voordat ze
worden afgesloten door DNA-ligase) en deze nicks (ook wel enkelstrengige breuken
genoemd) leveren het signaal dat het mismatch-proefleessysteem naar de juiste streng leidt.
MutS en MutL in eukaryoot en bacterie.
MutS bindt specifiek aan een mismatched basenpaar, terwijl
MutL het DNA scant op een nick. Zodra MutL een nick vindt,
activeert het de afbraak van de nicked streng helemaal terug
door de mismatch. Omdat nicks grotendeels beperkt zijn tot
nieuw gerepliceerde strengen in eukaryoten, worden
replicatiefouten selectief verwijderd. In bacteriën snijdt een
extra eiwit in het complex (MutH) niet-gemethyleerde (en
daarom nieuw gerepliceerde) GATC-sequenties, waardoor het
hier geïllustreerde proces begint. In eukaryoten bevat MutL een
DNA-nicking-activiteit die helpt bij het verwijderen van de beschadigde streng.
Winding probleem wordt verholpen door DNA topoisomerases.
Topoisomerase I: maakt single-strand break, geen ATP want gebeurt
snel
Topoisomerase II: double-strand break, wel ATP
(1) het breekt een dubbele helix omkeerbaar om een DNA-poort te
creëren;
(2) het zorgt ervoor dat de tweede, nabije dubbele helix door deze
opening gaat; en (3) het sluit dan de breuk weer af en dissocieert van
het DNA
Replicatie begint bij initiator proteins. Bij de
replication origins wordt de DNA helix geopend.
, E.coli kan alleen replicatie beheren met de initiatie.
Hemimethylated is als 1 van de 2 complementaire strengen is
gemethyleerd
DNA replicatie initiatie in eukaryoot
DNA replicatie in S fase.
DNA sequentie die origin of replication kan zijn bevat:
(1) een bindingsplaats voor een groot, multisubeenheid-
initiatoreiwit genaamd ORC, voor origin recognition complex
(2) een stuk DNA dat rijk is aan As en Ts en daarom
gemakkelijk te smelten is
(3) ten minste één bindingsplaats voor eiwitten die ORC-
binding vergemakkelijken, waarschijnlijk door de
chromatinestructuur aan te passen.
De ordelijke en snelle toevoeging van nieuwe H3-H4-
tetrameren en H2A-H2B-dimeren achter een replicatievork
vereist histon-chaperonnes
De uiteindelijke RNA-primer die op de lagging-strand-template is gesynthetiseerd, kan niet
worden vervangen door DNA omdat er geen 3'-OH-uiteinde beschikbaar is voor het
reparatiepolymerase. Zonder een mechanisme om dit probleem aan te pakken, zou bij elke
Hoofdstuk 5
Mutation = permanente verandering in DNA
Mutation rate = de snelheid waarmee veranderingen in DNA sequenties voorkomen
-Bacteriën hebben een mutation rate van 3 nucleotide veranderingen per 10 10 nucleotiden
per cel generatie.
-De mutation rate voor de mens is 1 nucleotide verandering per 10 8 nucleotiden per
generatie. En per celdeling 1 mutatie/1010 nucleotiden
2 soorten cellen van seksueel voortplantend dier of:
Geslachtscellen: dragen genetische informatie
over van ouder naar nageslacht
somatische cellen: vormen het lichaam van het
organisme
DNA polymerase voegt deoxyribonucleotide toe aan 3’ eind van nieuwe streng. De reactie
wordt aangedreven door een grote, gunstige verandering in vrije energie, veroorzaakt door
het vrijkomen van pyrofosfaat en de daaropvolgende hydrolyse tot twee moleculen
anorganisch fosfaat.
Replicatie gebeurd in replication fork. Hier synthetiseert een complex met DNA polymerase
de nieuwe dochterstrengen.
DNA polymerase maakt leading strand van 5’->3’ en lagging strand met okazaki fragmenten.
Heeft proofreading
De juiste nucleotide heeft een hogere affiniteit voor het bewegende
polymerase dan het verkeerde nucleotide, omdat de juiste paring
energetisch gunstiger is.
Exonucleolytic proofreading vindt plaats gelijk na de covalente binding van
verkeerde nucleotide. Met 3’->5’ proofreading exonuclease
RNA polymerase heeft geen primer nodig. Errors gaan niet naar volgende
generatie.
,DNA primase maakt korte RNA primers op de lagging strand. In
eukaryoten ongeveer 10 nucleotiden lang om de 100-200 nucleotiden.
Waarom RNA primer en geen DNA primer: de ribonucleotiden in de
primer markeren deze sequenties automatisch als "verdachte kopie" om
efficiënt te worden verwijderd en vervangen.
DNA helicase kan beide kanten op.
Single-strand DNA-binding (SSB) proteins, ook wel helix-destabiliserende
eiwitten genoemd, binden stevig en coöperatief aan blootgesteld
enkelstrengs DNA zonder de basen te bedekken, die daarom beschikbaar
blijven als sjablonen. Deze eiwitten zijn niet in staat om direct een lange
DNA-helix te openen, maar ze helpen helicases door de
afgewikkelde enkelstrengs conformatie te stabiliseren.
Bovendien bedekken ze, door middel van coöperatieve
binding, de gebieden van enkelstrengs DNA, die routinematig
voorkomen in de achterblijvende streng-matrijs, en maken ze
recht, waardoor de vorming van de korte haarspeldhelices
wordt voorkomen die zich gemakkelijk vormen in enkelstrengs
DNA. Als ze niet worden verwijderd, kunnen deze
haarspeldhelices de door DNA-polymerase gekatalyseerde
DNA-synthese belemmeren.
De sliding clamp houdt het polymerase stevig op het DNA wanneer het beweegt, maar laat
het los zodra het polymerase in een dubbelstrengs DNA-gebied loopt.
De assemblage van de klem rond het DNA vereist ATP-hydrolyse door een speciaal
eiwitcomplex, de clamp loader die ATP hydrolyseert terwijl het de klem op een primer-
sjabloon-junctie laadt.
De DNA-polymerase op de lagging-strand-template maakt ook gebruik van de klem, maar
elke keer dat de polymerase het 5'-uiteinde van het voorgaande Okazaki-fragment bereikt,
laat de polymerase zichzelf los van de klem en dissocieert het van de template. Dit
polymerasemolecuul associeert vervolgens met een nieuwe klem die wordt geassembleerd
op de RNA-primer van het volgende Okazaki-fragment.
,DNA polymerase op beide strengen.
Strand-directed mismatch repair
verwijdert fouten die de
proofreading exonuclease heeft
gemist en detecteert het potentieel
voor vervorming in de DNA-helix
van de misfit tussen niet-
complementaire basenparen.
In E.coli methylatie van A’s.
Eukaryoot: Nieuw gesynthetiseerd lagging-strand DNA bevat tijdelijk nicks (voordat ze
worden afgesloten door DNA-ligase) en deze nicks (ook wel enkelstrengige breuken
genoemd) leveren het signaal dat het mismatch-proefleessysteem naar de juiste streng leidt.
MutS en MutL in eukaryoot en bacterie.
MutS bindt specifiek aan een mismatched basenpaar, terwijl
MutL het DNA scant op een nick. Zodra MutL een nick vindt,
activeert het de afbraak van de nicked streng helemaal terug
door de mismatch. Omdat nicks grotendeels beperkt zijn tot
nieuw gerepliceerde strengen in eukaryoten, worden
replicatiefouten selectief verwijderd. In bacteriën snijdt een
extra eiwit in het complex (MutH) niet-gemethyleerde (en
daarom nieuw gerepliceerde) GATC-sequenties, waardoor het
hier geïllustreerde proces begint. In eukaryoten bevat MutL een
DNA-nicking-activiteit die helpt bij het verwijderen van de beschadigde streng.
Winding probleem wordt verholpen door DNA topoisomerases.
Topoisomerase I: maakt single-strand break, geen ATP want gebeurt
snel
Topoisomerase II: double-strand break, wel ATP
(1) het breekt een dubbele helix omkeerbaar om een DNA-poort te
creëren;
(2) het zorgt ervoor dat de tweede, nabije dubbele helix door deze
opening gaat; en (3) het sluit dan de breuk weer af en dissocieert van
het DNA
Replicatie begint bij initiator proteins. Bij de
replication origins wordt de DNA helix geopend.
, E.coli kan alleen replicatie beheren met de initiatie.
Hemimethylated is als 1 van de 2 complementaire strengen is
gemethyleerd
DNA replicatie initiatie in eukaryoot
DNA replicatie in S fase.
DNA sequentie die origin of replication kan zijn bevat:
(1) een bindingsplaats voor een groot, multisubeenheid-
initiatoreiwit genaamd ORC, voor origin recognition complex
(2) een stuk DNA dat rijk is aan As en Ts en daarom
gemakkelijk te smelten is
(3) ten minste één bindingsplaats voor eiwitten die ORC-
binding vergemakkelijken, waarschijnlijk door de
chromatinestructuur aan te passen.
De ordelijke en snelle toevoeging van nieuwe H3-H4-
tetrameren en H2A-H2B-dimeren achter een replicatievork
vereist histon-chaperonnes
De uiteindelijke RNA-primer die op de lagging-strand-template is gesynthetiseerd, kan niet
worden vervangen door DNA omdat er geen 3'-OH-uiteinde beschikbaar is voor het
reparatiepolymerase. Zonder een mechanisme om dit probleem aan te pakken, zou bij elke
